一種檢測AML患者預后基因突變的試劑盒及其檢測方法與流程

文檔序號:18145649發布日期:2019-07-10 11:47
一種檢測AML患者預后基因突變的試劑盒及其檢測方法與流程
本發明屬于生物技術檢測及試劑盒領域,具體涉及一種檢測AML患者預后基因突變的試劑盒及其檢測方法。
背景技術
:急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是一種造血系統的惡性腫瘤性疾病,以造血細胞的增殖失控,分化停滯,凋亡受阻為特征。AML所表現出的生物學特性是由本身的遺傳學異常所引起和決定的,傳統的細胞遺傳學可以在一半以上的AML患者中發現各類異常核型,這些核型異??梢詾槲覀兲峁┡袛嗷颊哳A后的依據。但是還有接近一半的患者缺乏特征性的核型異常,因而難以對這類患者進行判斷。而分子生物學技術則為我們發現微觀層面的遺傳學異常提供了更寬闊的視野,分子學標記的異常在白血病中也存在很大異質性,不同類型白血病基因異常位點通常有很大差異,隨著AML的研究逐漸深入化,越來越多的證據顯示,基因突變不僅在AML的發生中發揮極其重要的作用,同時也控制著疾病的進展與結局。因此,發現并驗證一些新的生物學標記對于改善其預后具有極其重要的意義,這些分子水平改變的發現,不僅提供了解釋AML發病機制的新視角,而且有助于建立新的AML危險分層體系,為臨床靶向治療提供依據。Sanger測序法是目前公認的,大多數臨床分子診斷項目的金標準,特異性甚至能達到100%,是分子診斷方面的經典技術平臺。為了給Sanger測序提供可靠的模板,首先必須針對該項目的特點,建立一個穩定可靠的PCR體系。該項目PCR部分在技術環節存在以下兩個難點:1.該項目需要提取血液基因組DNA,由于臨床標本物流運輸中存在眾多不可控因素,因此臨床檢驗中往往得不到質量優良的全血標本,因此獲得的DNA質量也會存在較大的樣本間差異。2.由于需檢測的外顯子數目較多,即PCR目的片段過多,導致PCR條件不統一。技術實現要素:針對現有技術中所存在的問題,本發明的目的在于提供一種檢測AML患者預后基因突變的試劑盒及其檢測方法,該試劑盒可用于檢測NRAS基因、RUNX1基因、TP53基因和WT1基因序列的突變位點,特異性好,靈敏度高。為了實現上述目的及其他相關目的,本發明采用如下技術方案:本發明的第一方面,提供一種檢測AML患者預后基因突變的試劑盒,所述試劑盒包括:NRAS基因的PCR擴增引物、RUNX1基因的PCR擴增引物、TP53基因的PCR擴增引物、WT1基因的PCR擴增引物以及通用測序引物接頭。優選地,所述NRAS基因的PCR擴增引物至少包括核苷酸序列如SEQIDNO.1~4所示的引物。優選地,所述RUNX1基因的PCR擴增引物至少包括核苷酸序列如SEQIDNO.5~22所示的引物。優選地,所述TP53基因的PCR擴增引物至少包括核苷酸序列如SEQIDNO.23~40所示的引物。優選地,所述WT1基因的PCR擴增引物至少包括核苷酸序列如SEQIDNO.41~44所示的引物。優選地,所述通用測序引物接頭至少包括核苷酸序列如SEQIDNO.45~46所示的引物接頭。本發明的試劑盒采用PCR檢測技術進行NRAS基因、RUNX1基因、TP53基因、WT1基因突變位點檢測,NRAS基因的PCR擴增引物、RUNX1基因的PCR擴增引物、TP53基因的PCR擴增引物、WT1基因的PCR擴增引物以及通用測序引物接頭的設計是本發明試劑盒的關鍵?;诒景l明所述試劑盒是采用PCR檢測技術來進行檢測的,所以試劑盒中還可以包括其他一些PCR所需要的常規試劑,如樣本基因組DNA提取試劑、PCR擴增反應試劑、測序用試劑。一般地,PCR擴增反應試劑選自premixTaq、ddH2O。由于此類PCR常用試劑均可經市場途徑單獨購得或者自行配置,因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒,可以根據客戶實際需要配置,為方便起見,也可全部裝配入試劑盒。本發明的試劑盒,可以是含有獨立包裝的引物對,也可以是含有配置好的含有引物對的PCR擴增反應試劑。所述PCR擴增反應試劑可自行配置,也可直接以市售的不含引物對的通用PCR反應試劑加入引物對獲得。例如,所述試劑盒中還可以含有premixTaq、ddH2O。加入本發明的引物對、待檢樣本基因組DNA提取物即可獲得PCR反應體系。優選地,所述試劑盒中還可含有陽性對照。所述陽性對照為臨床上已經確診為AML患者的基因組DNA。優選地,所述試劑盒中還可含有陰性對照。所述陰性對照為正常人的樣本基因組DNA。本發明的第二方面,提供了前述檢測試劑盒的使用方法,包括如下步驟:(1)提取樣本基因組DNA;(2)采用前述NRAS基因的PCR擴增引物、RUNX1基因的PCR擴增引物、TP53基因的PCR擴增引物、WT1基因的PCR擴增引物對樣本基因組DNA進行擴增;(3)對擴增產物添加前述通用測序引物接頭后進行測序;(4)對測序結果進行分析。優選地,所述檢查方法為非疾病診斷目的的方法。步驟(1)中,提取樣品基因組DNA為現有技術。本發明的第三方面,提供了前述試劑盒在制備AML患者預后基因突變檢測產品中的用途。與現有技術相比,本發明具有如下有益效果:使用本發明試劑盒,采用測序技術,對NRAS基因、RUNX1基因、TP53基因和WT1基因突變進行檢測??梢酝ㄟ^特異性PCR擴增引物、和帶熒光標記的ddNTP,檢測出與AML預后相關的基因突變位點,有利于準確進行AML的危險度劃分及分層治療。附圖說明圖1A:RUNX1基因突變型的測序峰圖。圖1B:TP53基因突變型的測序峰圖。圖1C:WTI基因基因突變型的測序峰圖。圖1D:NRAS基因基因突變型的測序峰圖。具體實施方式NRAS基因RAS是細胞內重要的原癌基因,Ras基因是許多腫瘤細胞信號傳導途徑的關鍵,許多腫瘤細胞都有Ras基因突變。AML的Ras基因突變率約25%,ALL約6%--20%,CMML的Ras突變率也很高。Ras基因家族有三個結構類似的成員,即H-Ras、K-Ras和N-Ras,其中和AML發生相關的主要是NRas基因,基因全長85kb,其cDNA長約2.1kb,編碼含495個氨基酸的蛋白,稱為p21Ras,p21是一種膜結合G蛋白,參與信號傳導途徑。Ras基因激活的方式有3種:基因點突變、基因大量表達、基因插入及轉位。其中Ras基因被激活是最常見的方式就是點突變,多發生在N端第12、13和61密碼子,其中又以第12密碼子突變最常見,而且多為GGT突變成GTT。不同突變位點對P21的活化機制不同,第12密碼子突變可以減弱P21內在的GTP酶活性,并使細胞凋亡減少、細胞間接觸抑制減弱;第61密碼子突變可削弱GAP對P21的內在GTP酶活性,并可減弱GAP與P21結合的穩定性。Ras蛋白在白血病的起始和發展過程中起重要的作用。成熟的Ras蛋白在胞漿中合成,定位于質膜的內表面。然后被轉運和修飾。其修飾發生于具有羥基末端的CAAX功能域,同時需要膜的協助。修飾的第一階段是首先去除AAX殘基,與半胱氨酸的a羥化物接觸。后者被膜甲基轉移酶甲基乙?;?。然后,Cys-186的巰基被法尼基化。第二階段是位于蛋白(HRAS的Cys-181和Cys-184;NRAS的Cys-181)的超變區的半胱氨酸棕櫚?;?。然后蛋白被靶向和結合于質膜,并在那里被活化。當Ras蛋白接受信號刺激或自身突變活化后主要通過刺激①增殖途徑Raf/Mek/Erk②抗凋亡途徑P13K/Akt兩條途徑上蛋白磷酸化,它們在體內發揮著一系列重要的生物學效應,一旦這兩條途徑因為某種原因處于持續激活狀態,表現為蛋白的磷酸化,將導致多種惡性疾病(AML)的發生。RUNX1基因RUNX1(runt-relatedtranscriptionfactor1)作為重要造血相關轉錄因子,在造血發育的多個階段發揮重要作用。Runx1是Runx家族一員,在哺乳動物發育過程中,Runx家族由Runx1,Runx2,Runx3構成,他們都含有128個氨基酸組成的保守序列構成DNA結合結構域,不同成員結合相同的DNA位點,但在發育過程中發揮不同的作用。以往認為涉及RUNX1基因白血病的主要發病機制是融合基因的形成,如t(8;21)-AMLl(RUNX1)/ETO(MTG8)、t(3;21)-RUNXl/EVll和t(12;21)-TEL(ETV6)/RUNXl。目前已發現10余種涉及RUNX1的染色體易位所致的融合基因,盡管每種融合基因致白血病的機制各異,但其所涉及的共同發病機制則都是抑制了野生型RUNXl基因的活性。然而最近的研究表明RUNXl基因突變也參與白血病的發生,其單等位基因的突變可造成家族性血小板異常(FPD),進而使發生急性髓系白血病(AML)的易感性增強,稱為FPD/AML。在M0中點突變主要發生在Runt區,而在MDS-AML中突變主要發生在C-末端。轉錄調控因子RUNX1突變在AML及MDS患者發生率較高,分別為13.1%和17.5%。RUNX1基因編碼RUNX1蛋白,與CBFβ相結合形成核心結合因子轉錄復合體,調控多個造血相關基因表達。目前累及RUNX1突變主要為2類:①發生在RUNX1N-末端(常見突變RUNX1D171N),主要在RHD結構域,影響RUNX1與DNA結合;②發生在RUNX1C-末端(常見突變RUNX1s291fs),可增強RUNX1與DNA結合,但影響其轉錄活性MLL基因異常是另一種MDS及MDS/AML常見的遺傳學改變。研究表明,MDS患者疾病進展時常同時存在MLL-PTD及RUNX1突變,且在原發和繼發性AML中,同時存在突變的比例更高。該基因突變檢測結合基因芯片的檢測,能更好的輔助診斷AML。TP53基因/TP53基因是重要的抑癌基因之一,其編碼的蛋白--腫瘤抑制蛋白P53能夠使許多基因保持其穩定性,并調節細胞的生長、分化、衰老,避免疾病產生,被稱為“基因守護者”。當TP53基因缺失、突變和調節紊亂時,將直接影響P53蛋白的功能和活性,從而導致很多腫瘤的發生;除此之外TP53的基因狀態也成為判斷淋巴瘤和血液病預后的重要指標。TP53基因通過細胞核中轉錄依賴的活性(TA)和細胞漿中非轉錄依賴的活性(TIA)兩種途徑發揮著抑癌的作用。TP53通過轉錄依賴的功能調節基因的轉錄,影響細胞周期、DNA修復、凋亡、信號傳導、轉錄和代謝;通過非轉錄依賴的功能誘導凋亡和自吞噬。TP53基因的突變和調節異常會導致很多腫瘤的發生。雖然在血液病和淋巴瘤中,TP53缺失和突變的頻率沒有其它腫瘤高,但是TP53基因編碼區的缺失、重排和突變將使得其編碼的P53蛋白的表達、穩定性和活性紊亂,TP53基因的狀態已成為判斷血液病和淋巴瘤預后的重要指標。另一方面,克服TP53異常也成為疾病治療的一個新靶點。TP53位于染色體的17q13.1,長19144個核苷酸,其中2586個核苷酸轉錄成TP53的mRNA,包括第1和第2外顯子的5,非轉錄區(UTR),第11外顯子的3’非轉錄區(UTR)和第2-11外顯子的編碼區(~20KB),編碼由393aa組成的P53蛋白。P53蛋白的DNA結合區(DBD)是TP53基因發揮轉錄依賴活性和非轉錄依賴活性最重要的一個區域,所以TP53的突變很多都發生在編碼DBD的第4~8外顯子區域。TP53正常功能的喪失主要通過基因突變。突變可引起兩方面的改變:(1)突變體失去與特異位點的結合能力。野生型P53以四聚體形式與特異位點結合,反式激活下游生長抑制基因的表達。在一些腫瘤中,單一或兩個P53位點的喪失使形成四聚體的比例下降,無義突變造成P53翻譯中斷,c端酸性結構域的缺失影響四聚體形成;最常見的是錯義突變后野生型與突變型形成更穩定的四聚體,減弱內源野生型P53的負調控作用,從而引起細胞惡變。(2)突變改變了P53的球形構象。例如,一些突變體可與熱休克蛋白結合,一些突變引起213~217肽段的暴露,另外一些則引起酸性激活結構域的改變,這些突變均提示P53的微小改變可引起遠離突變位點區段甚至整個蛋白構象的改變?;虍惓2粌H是AML的發病機制之一,同時也是AML患者重要的預后因素。TP53基因的改變與年齡、基因異常的復雜性、特殊染色體異常、單一核型有關,并且預示預后較差。有文獻報道P53功能缺失與化療如阿糖胞苷抵抗相關。近年來又發現TP53的改變與臨床上誘導化療抵抗密切相關。51%攜帶P53基因突變的CK-AML患者治療后有復發,而未有TP53基因異常的CK-AML患者復發率僅35%。攜帶有TP53基因突變的CK-AML患者的中位生存時間只有4.14個月,而無TP53基因突變的CK-AML患者的中位生存時間為10.97個月。因此TP53的突變應該作為臨床常規檢測用以指導臨床用藥和提示預后。WT1基因WT1基因位于定位于11P13,編碼含429個氨基酸的蛋白質。該蛋白由DNA結合區的羧基端與轉錄活性調節區的氨基末端構成。King-UnderwoodL首次報道了AML存在WT1基因突變,并認為該突變與AML發生有關。隨后的研究證實,目前約有10-15%的AML患者存在WT1基因突變。近年來WT1(Wilms’tumorsusceptibilitygene)基因在腫瘤發生中的作用受到重視,但其確切作用及作用機制仍不清楚。WT1基因最初被當做抑癌基因發現在Wilms瘤,位于11p13,是一種調控腎臟發育的轉錄因子。該基因在正常腦組織、胎盤、脾臟及造血組織均有表達。WT1基因可調節與生長分化有關的一些生長因子:WT1基因不是一單純的抑癌基因,同時具有癌基因的功能。2004年Hosen等報道WT1基因相關功能更傾向于一種轉錄激活因子,能特異識別并與靶基因DNA結合,起調節轉錄作用。胡紹燕等利用實時定量逆轉錄聚合(RQ-RT-PCR)反應技術檢測急性髓系白血病病人骨髓細胞中WT1基因表達水平較正常人明顯升高,WT1基因與急性髓系白血病的長生存及無病生存有關,提示WT1基因可能參與了急性髓系白血病的發病過程,考慮把WT1基因作為判斷急性髓系白血病預后的指標及檢測微小殘留病的標記。WT1基因長約50Kb,含10個外顯子,編碼區約1300bp,其5’端編碼其它轉錄因子的調節區,3’端為鋅指保守序列高度同源區。結構中較重要的是2個外顯子是隨機組合的剪接外顯子:剪接變體I和剪接變體Ⅱ。剪接變體I位于外顯子5,編碼17個氨基酸插入鋅指結構和調控區,稱為WT1+17AA/WT1-17AA;剪接變體Ⅱ位于外顯子9與外顯子10之間,由編碼3個氨基酸(賴氨酸-蘇氨酸-絲氨酸)插入第3和第4鋅指區之間,稱為WT1+KTS/WT1-KTS。WT1基因功能的喪失可導致細胞過度生長增值、腫瘤發生?;蚬δ芨淖兊闹饕獧C制是點突變或部分缺失。點突變是WT1功能喪失的最常見原因,主要包括移碼突變、無義突變、錯義突變。部分缺失是WT1失活的另一種機制。有研究證實破壞WT1蛋白功能會促進造血細胞增殖和抑制細胞分化,也有研究顯示WT1突變的存在是正常核型AML患者預后不良的影響因素,已有的研究發現外顯子7、8、9、10是突變的熱點,HollinkIH等進一步報道WT1基因突變主要集中在外顯子。然而,DammF等最新報道有些WT1突變,如SNPrs16754可能是一個獨立的判斷預后的有利標記。WT1基因表達水平增高或WT1基因突變與AML患者的臨床預后和治療效果密切相關。因此,本發明提供一種檢測AML患者預后基因突變的試劑盒,所述試劑盒包括NRAS基因的PCR擴增引物、RUNX1基因的PCR擴增引物、TP53基因的PCR擴增引物以及通用測序引物接頭。在進一步描述本發明具體實施方式之前,應理解,本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案;還應當理解,本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案,而不是為了限制本發明的保護范圍。當實施例給出數值范圍時,應理解,除非本發明另有說明,每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義,本發明中使用的所有技術和科學術語與本
技術領域
技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外,根據本
技術領域
的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載,還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。實施例1檢測AML患者預后基因突變的試劑盒的制備本發明的試劑盒包括NRAS基因的PCR擴增引物、RUNX1基因的PCR擴增引物、TP53基因的PCR擴增引物、WT1基因的PCR擴增引物以及通用測序引物接頭,其核苷酸序列詳見下表1所示:表1實施例2檢測AML患者預后基因突變的試劑盒的應用1.樣本抽提操作步驟:(1)采集待測血液樣本,置于1.5ml離心管中,加500μLBufferAP1到所述1.5ml離心管中;(2)加200-250μL抗凝全血到BufferAP1中,蓋緊離心管蓋子,旋渦振蕩10s;(3)加100μLBufferAP2,旋渦振蕩10s,白色沉淀和深紅色裂解液充分混勻成灰褐紅色;(4)12,000×g離心10min;(5)將制備管置于2ml離心管中,將步驟(4)中的上清液加入到制備管中,12,000×g離心1min;(6)棄濾液,將制備管置回到原2ml離心管中,加700μLBufferW1A,室溫放置2min12,000×g離心30s;(7)棄濾液,將制備管置回到原2ml離心管中,加800μL已加無水乙醇的BufferW2,12,000×g離心1min;(8)(可選步驟)將制備管置回到原2mL離心管中,加500μLBufferW2到制備管中,12,000×g離心1min;(9)棄濾液,將制備管置回原2mL離心管,12,000×g離心2min;(10)將制備管置于另一潔凈的1.5mL離心管中,開蓋室溫放置1min,在制備管膜中央加80-200μLBufferTE,室溫靜置1min。12,000×g離心1min洗脫基因組DNA。由此提取獲得樣本基因組DNA。2.實驗過程(1)采用實施例1試劑盒中的NRAS基因的PCR擴增引物、RUNX1基因的PCR擴增引物、TP53基因的PCR擴增引物、WT1基因的PCR擴增引物共22對擴增引物對分別配制PCR反應試劑共22種,每對擴增引物對對應于一種PCR反應試劑,所述擴增試劑如下表2所示:表2試劑名稱用量(uL)premixTaq10引物對中的上游引物(5uM)1引物對中的下游引物(5uM)1ddH2O6具體地,NRAS-2-F和NRAS-2-R所對應的PCR反應試劑如表3所示:表3試劑名稱用量(uL)premixTaq10NRAS-2-F(5uM)1NRAS-2-R(5uM)1ddH2O6以此類推,其他各PCR反應試劑中,除了引物對與表3中不同以外,其他組分均相同。將上述22種PCR反應試劑分別至于對應的PCR反應管中,每個反應管中放置一種PCR反應試劑20uL,共獲得22種PCR反應管。(2)將上述步驟1中獲得的每一種樣本基因組DNA都分為22份,每份的體積為2μL,然后分別加入到22種PCR反應管中,每一種樣本對應獲得22個樣本反應管;將同一種陽性對照(所述陽性對照為臨床上已經確診為AML患者的基因組DNA)分為22份,每份的體積為2μL,然后分別加入到22種PCR反應管中,同一種陽性對照對應獲得22個陽性對照反應管;將同一種陰性對照(所述陰性對照為正常人的樣本基因組DNA)分為22份,每份的體積為2μL,然后分別加入到22種PCR反應管中,同一種陰性對照對應獲得22個陰性對照反應管;(3)將各個樣本反應管、陽性對照反應管、陰性對照反應管,分別各自混勻,低速離心數秒,進行PCR擴增:含有NRAS基因的PCR擴增引物的反應管以及含有RUNX1基因的擴增引物的反應管,進行PCR擴增時,PCR反應條件,見下表4:表4含有TP53基因的PCR擴增引物的反應管以及含有WT1基因的擴增引物的反應管,進行PCR擴增時,PCR反應條件,見下表5:表53.Sanger測序的具體步驟如下:3.1測序PCR:3.1.1試劑配制:按下表6進行,冰上操作,分裝后保存在-20℃冰箱。BigDye體系:表6表7酶純化體系:原料1X需要體積量(ul/管)CIP0.1ul-ExoI0.5ul-去離子水1.4ul-3.2PCR產物純化3.2.1取出分裝好的純化反應液,在管壁上標好相應的編號。3.2.2取9ulPCR產物加入相應編號的管中,混勻(注意不能產生氣泡)。3.2.3將混勻樣品按照如下反應條件上PCR儀,進行酶純化擴增。3.2.4純化好的樣品用于下一步測序反應,如當日不用放冷凍保存。3.3測序反應3.3.1每個樣品做正反兩個反應,在相應的薄壁管上寫好標記。3.3.2每反應體系5ul,BigDye混合液和5P引物固定加1ul,模板一般加2ul,最大量為3ul(根據PCR產物電泳結果調整),用水補足5ul。3.3.3先加相應量的水,然后加入相應的1ul測序引物接頭(M13-F和M13-R)加到水里,再在管壁的不同地方加1ul的BigDye混合液,最后加入模板。3.3.4蓋上管蓋低速短暫離心,渦旋器混勻,再次低速短暫離心。3.3.5按照如下反應條件上PCR儀,進行測序反應。3.4.測序反應后乙醇純化,上機。3.4.1將擴增完的PCR產物進行短暫離心。在每管一側貼壁加入2ul的125mMEDTA,然后在管的另一側貼壁加入15ul無水乙醇,渦旋混勻。3.4.2用板式離心機,4000rpm,離心30min,然后300rpm倒置瞬時離心,除掉上清。3.4.3加入50ul的20℃預冷75乙醇,渦旋混勻,4000rpm、4℃離心15min。3.4.4300rpm倒置瞬時離心,除掉上清,然后放置于室溫,15min,揮發完乙醇。3.4.5乙醇完全揮發后,每管加入水和Hi-DiTM各5ul,充分渦旋振蕩1min.,短暫離心后靜置15min.使測序產物完全溶解。3.4.6將Hi-DiTM溶解產物轉移至96孔板的相應位置中。放至PCR擴增儀上,95℃預變性5min.,迅速轉移至冰盒上4℃冷卻5min。至3500測序儀上機測序并分析。數據分析:應用sequencinganalysis軟件進行序列比對分析。將測序得到的序列與NCBI中檢索到的標準序列進行比對,確認樣本的基因序列。4.臨床標本比對:前期臨床標本檢測已確定突變位點的樣本30例,本發明試劑盒檢測結果符合率90%。溶解溫度(Tm)也是PCR中一個很重要的參數,對于設定PCR退火溫度是必須的,合適的退火溫度能夠有效的減少非特異性結合,還能保證目的序列有效退火。所以在保證特異性的情況下,設計引物的Tm值盡量接近,使PCR的退火溫度可以保持一致,從而達到PCR條件的統一。因此,使用本發明試劑盒,采用測序技術,對NRAS基因、RUNX1基因、TP53基因和WT1基因突變進行檢測??梢酝ㄟ^特異性PCR擴增引物、和帶熒光標記的ddNTP,檢測出與AML預后相關的基因突變位點,有利于準確進行AML的危險度劃分及分層治療。此外,由于本發明采用了特殊的通用測序引物接頭,測序引物接頭不能等同于PCR擴增引物,測序引物接頭要求要更嚴格一些,測序引物要求3,端必須要完全配對,不能含有混合堿基,而且長度20bp左右,GC含量在50%-60%之間;另外,由于需檢測的外顯子數目較多,即Sanger測序時所需引物較多,在測序反應時會造成工作量較大,同時也增加了錯誤率的發生,給實驗造成了很大的不便,本發明通過在特異性PCR擴增引物5,端加上特殊測序通用引物接頭,通過對比發現,加上所述測序通用引物之后,在Sanger測序時比不加所述測序引物接頭可節約15min-30min的時間,同時可以大大降低由非通用測序引物造成的錯誤率,從而顯著提高工作效率。上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效,而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下,對上述實施例進行修飾或改變。因此,舉凡所屬
技術領域
中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變,仍應由本發明的權利要求所涵蓋。序列表<110>上海新培晶醫學檢驗所有限公司<120>一種檢測AML患者預后基因突變的試劑盒及其檢測方法<130>176816<160>46<170>SIPOSequenceListing1.0<210>2<211>43<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2gtaaaacgacggccagtggttttcatttccattgattatagaa43<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3ggaaacagctatgaccatgtcagcgggctacca33<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3gtaaaacgacggccagtgggcagaaatgggcttga35<210>4<211>44<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4ggaaacagctatgaccatgctgtagaggttaatatccgcaaatg44<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5gtaaaacgacggccagtgatgtagggctagaggggtga38<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>6ggaaacagctatgaccatgacaggcaaagctgagcaaaa39<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>7gtaaaacgacggccagtgccacgtgcataaggaacagt38<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>8ggaaacagctatgaccatgtggaatcagcagaaacagcc39<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>9gtaaaacgacggccagtgaaaggcccctgaacgtgtat38<210>10<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>10ggaaacagctatgaccatgaaagctgagacgagtgcctc39<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>11gtaaaacgacggccagtgtcattgctattcctctgcaacc40<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>12ggaaacagctatgaccatgtgtgggtttgttgccatgaa39<210>13<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>13gtaaaacgacggccagtggccaaaattccgggagtgtt38<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>14ggaaacagctatgaccatgggtccctgagtataccagcc39<210>15<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>15gtaaaacgacggccagtggacagtggccccaaattcag38<210>16<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>16ggaaacagctatgaccatgctgttggttcgaggcctttc39<210>17<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>17gtaaaacgacggccagtgtgaacaagggccactcatttc39<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>18ggaaacagctatgaccatgccaactccttcatgcacctc39<210>19<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>19gtaaaacgacggccagtgctaggcggtatcatcctggg38<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>20ggaaacagctatgaccatgatggagaactggtaggagcc39<210>21<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>21gtaaaacgacggccagtgccctcctaccacctgtactac39<210>22<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>22ggaaacagctatgaccatgttgtcgcgaacaggaggccc39<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>23gtaaaacgacggccagtgagcagccattcttttcctgct39<210>24<211>40<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>24ggaaacagctatgaccatgattttcgcttcccacaggtct40<210>25<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>25gtaaaacgacggccagtgccccctctgagtcaggaaaca39<210>26<211>40<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>26ggaaacagctatgaccatgaggaagccaaagggtgaagag40<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>27gtaaaacgacggccagtggaggtgtagacgccaactct38<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>28ggaaacagctatgaccatgatcagtgaggaatcagaggc39<210>29<211>41<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>29gtaaaacgacggccagtgccatgagcgctgctcagatagcg41<210>30<211>43<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>30ggaaacagctatgaccatgtactgctcacctggagggccactg43<210>31<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>31gtaaaacgacggccagtgttgccacaggtctccccaag38<210>32<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>32ggaaacagctatgaccatgccggggatgtgatgagaggt39<210>33<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>33gtaaaacgacggccagtgccagaaaggacaagggtggt38<210>34<211>40<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>34ggaaacagctatgaccatgatctgaggcataactgcaccc40<210>35<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>35gtaaaacgacggccagtgccaagggtgcagttatgcct38<210>36<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>36ggaaacagctatgaccatgagctacaaccaggagccatt39<210>37<211>41<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>37gtaaaacgacggccagtgtacttacttctccccctcctctg41<210>38<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>38ggaaacagctatgaccatgagatggggtcagctgccttt39<210>39<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>39gtaaaacgacggccagtgggcccttcaaagcattggtc38<210>40<211>40<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>40ggaaacagctatgaccatgtctcccaaacatccctcacag40<210>41<211>38<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>41gtaaaacgacggccagtgcatggggatctggagtgtga38<210>42<211>39<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>42ggaaacagctatgaccatgtcagaatgcaaaatggcccc39<210>43<211>42<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>43gtaaaacgacggccagtgtgcagacattgcaggcatggcagg42<210>44<211>43<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>44ggaaacagctatgaccatggcactattccttctctcaactgag43<210>45<211>18<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>45gtaaaacgacggccagtg18<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>46ggaaacagctatgaccatg19當前第1頁1 2 3 
再多了解一些
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