一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法與流程

文檔序號：18145675發布日期：2019-07-10 11:47

本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法。

背景技術：

1983年，世界上首例轉基因作物也即是轉基因煙草在美國研發成功；1994年，美國Monsanto公司的延熟保鮮轉基因西紅柿在美國批準上市；數十年來，轉基因作物在世界范圍內廣泛應用，也引起了無數爭議。

我國發布的轉基因煙草的相關規范有國煙法[1998]168號《煙草基因工程研究及其應用管理辦法》、國煙科[2003]387號《國家煙草專賣局關于加強對轉基因煙草監控的通知》及在2005至2006年還陸續傳達了加強出口煙草轉基因檢測的幾個文件。由于煙草作為轉基因模式作物，研究最早、范圍較廣，因而在部分檢測機構抽檢中也有發現。目前PCR技術是檢測和鑒定轉基因產品的主流方法，通過在樣品DNA中檢測某外源基因，從而判定樣品是否含有該轉基因成分。

樣品中DNA的提取，從操作方式可分為自動化提取，如尚未普及的自檢工作站；半自動化提取，如已逐漸普及的核酸提取儀；手動提取，如當前常見的商品化試劑盒、自制試劑等。

種子和新鮮煙葉DNA損失小且較完整，上述三種方法均可適用，通常DNA純度OD260/OD280為1.6至1.8，濃度在ng/μL級，可略作稀釋或直接用于PCR檢測。

烤后煙葉和卷煙DNA損失大且碎片化，自動化、半自動化的方法得率較低；通常采用手動提取的方法。因為樣品種類、研究方式區別很大，手動提取的方法也種類廣泛、差異顯著，效果因而參差不齊。

第一代PCR技術，通常稱為普通PCR技術，先設計物種特異基因的引物，再將樣品DNA和引物及擴增試劑混勻后通過PCR儀對目的基因進行反復擴增，然后通過電泳對擴增產物進行鑒定，從而判定是否含有該物種源性成分。

第二代PCR技術為實時定量熒光PCR，通常簡稱熒光PCR。除了設計物種特異基因的引物外，再設計一條熒光探針。將樣品DNA、引物、探針及擴增試劑混勻后通過實時定量熒光PCR儀(通常簡稱熒光PCR儀)對目的基因進行反復擴增，探針的熒光信號累積與基因擴增同步，相對普通PCR，既提升了擴增時的特異性，擴增結束后也立即獲得檢測結果。

多重實時定量熒光PCR(以下簡稱多重熒光PCR)屬于熒光PCR的一種，針對多個物種特異基因，逐個設計引物和探針，不同探針分別標記上不同波長的熒光基團。將樣品DNA、引物、探針及擴增試劑混勻后通過多通道熒光PCR儀對多個目的基因進行反復擴增，通過監測多個熒光信號達到同時檢測多個目的基因的要求。相對普通熒光PCR，每增加一套引物和探針即可將檢測效率提升一倍、并將其他試劑成本降低一倍。

中國專利數據庫中涉及轉基因成分鑒定的PCR技術的專利申請件已有百余件，但多為普通PCR方法和熒光PCR方法，利用多重熒光PCR技術對煙草轉基因的研究在國內還是空白，因此，提供一種多重熒光PCR檢測煙草轉基因的方法是目前亟待解決的問題。

技術實現要素：

本發明提供了一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法，其目的在于提供一種高效率，低成本，檢測結果準確的轉基因煙草的檢測方法。

其具體技術方案如下：

本發明選定的具體內源基因和外源基因包括：

(1)內源基因：Nr，英文名：Nicotiana tabacum nitrate reductase；中文名：煙草硝化還原酶。

(2)外源基因/通用元件：CaMV35S，英文名：35promoter form cauliflomer mosaic virus；中文名：花椰菜花葉病毒35S啟動子。

(3)外源基因/通用元件：NOS，英文名：Nopaline synthase terminator；中文名：胭脂堿合成酶3’轉錄終止子。

(4)外源基因/通用元件：NPT II，英文名：Neomycin phosphotransferase II；中文名：新霉素-3’-磷酸轉移酶。

(5)外源基因/品系基因：Btc，英文名：Bacillus thuringiensis CryIA(b)/CryIA(c)fusion gene；中文名：編碼蘇云金芽孢桿菌CryIA(b)和CryIA(c)殺蟲晶體蛋白基因經人工拼接形成的基因。

(6)外源基因/品系基因：CpTI，英文名：Cowpea trypsin inhibitor；中文名：豇豆胰蛋白酶抑制劑。

(7)外源基因/品系基因：EPSPS，英文名：5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase；中文名：5-莽草酸-3-磷酸合成酶。

(8)外源基因/品系基因：CMV-cp，英文名：Cucumber mosaic virus coat protein；中文名：煙草花葉外殼蛋白。

(9)外源基因/品系基因：PVY-cp，英文名：Potato Y virus coat protein；中文名：馬鈴薯Y病毒外殼蛋白。

(10)外源基因/品系基因：TMV-cp，英文名：Tobacco mosaic virus coat protein；中文名：煙草花葉病毒外殼蛋白。

(11)外源基因/品系基因：CMV-sat，英文名：Cucumber mosaic virus microsatellite RNA；中文名：黃瓜花葉病毒微衛星RNA。

(12)外源基因/品系基因：PVY-Nib，英文名：Potato Y virus nuclear inclusion b；中文名：馬鈴薯Y病毒復制酶。

(13)外源基因/品系基因：TMV-54kD，英文名：Tobacco mosaic virus 54kD protein；中文名：煙草花葉病毒復制酶。

本發明提供了一種檢測轉基因煙草的多重熒光PCR基因位點，包括：

Nr基因：檢測位點為檢測位點為NCBI的Genbank中JN384020.1的501至630bp。

Btc基因：檢測位點為NCBI的Genbank中EU816953.1的EU816953.1的540至657bp。

CpTI基因：檢測位點為NCBI的Genbank中AJ271752.1的AJ271752.1的599至720bp。

EPSPS基因：檢測位點為NCBI的Genbank中AY592954.1的AY592954.1的243至614bp。

CMV-cp基因：檢測位點為NCBI的Genbank中KJ513406.1的KJ513406.1的312至436bp。

PVY-cp基因：檢測位點為NCBI的Genbank中KX376949.1的KX376949.1的317至407bp。

TMV-cp基因：檢測位點為NCBI的Genbank中KJ508033.1的KJ508033.1的285至424bp。

CMV-sat基因：檢測位點為NCBI的Genbank中EF363687.1的EF363687.1的224至358bp。

PVY-nib基因：檢測位點為NCBI的Genbank中EF470240.1的EF470240.1的1305至1453bp。

TMV-54D基因：檢測位點為NCBI的Genbank中X66047.1的X66047.1的559至651bp。

多重熒光PCR基因位點還包括CaMV35S、NPT II、NOS基因位點為通用的基因位點。

本發明設計內源基因和品系基因的引物和探針時，在NCBI的Genbank中檢索到數十條相關序列，運用Lasergene v7.1.0的MegAlign比對出保守區域，利用Oligo v7.0.2設計引物和探針，先用NCBI的Primer-Blast進行驗算，最后進行實際驗證。

本發明針對上述多重熒光PCR基因位點還提供了一種檢測轉基因煙草的多重熒光PCR引物，包括：

針對上述多重熒光PCR基因位點的Nr基因的單重引物，Btc、CpTI、EPSPS基因的三重引物，CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp基因的三重引物，CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD基因的三重引物；

所述Nr基因的引物為：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

所述Btc基因的引物為：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；

所述CpTI基因的引物為：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；

所述EPSPS基因的引物為：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；

所述CMV-cp基因的引物為：SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；

所述PVY-cp基因的引物為：SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；

所述TMV-cp基因的引物為：SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；

所述CMV-sat基因的引物為：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；

所述PVY-Nib基因的引物為：SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24；

所述TMV-54kD基因的引物為：SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26。

多重熒光PCR引物還包括CaMV35S、NPT II、NOS基因的三重引物，

CaMV35S基因的引物為：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

NPT II基因的引物為：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

NOS基因的引物為：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

本發明還提供了一種檢測轉基因煙草的多重熒光PCR探針，其特征在于，包括Nr基因的單重探針，Btc、CpTI、EPSPS基因的三重探針，CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp基因的三重探針，CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD基因的三重探針；

所述Nr基因的探針為SEQ ID NO.27，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述Btc基因的探針為SEQ ID NO.31，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述CpTI基因的探針為SEQ ID NO.32，熒光探針修飾為：5’-HEX，3’-MGB；

所述EPSPS基因的探針為SEQ ID NO.33，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB；

所述CMV-cp基因的探針為SEQ ID NO.34，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述PVY-cp基因的探針為SEQ ID NO.35，熒光探針修飾為：5’-HEX，3’-MGB；

所述TMV-cp基因的探針為SEQ ID NO.36，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB；

所述CMV-sat基因的探針為SEQ ID NO.37，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

所述PVY-Nib基因的探針為SEQ ID NO.38，熒光探針修飾為：5’-HEX，3’-MGB；

所述TMV-54kD基因的探針為SEQ ID NO.39，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB。

多重熒光PCR探針還包括CaMV35S、NPT II、NOS基因的三重探針，CaMV35S基因的探針為SEQ ID NO.28，熒光探針修飾為：5’-FAM，3’-MGB；

NPT II基因的探針為SEQ ID NO.29，熒光探針修飾為：5’-HEX，3’-MGB；

NOS基因的探針為SEQ ID NO.30，熒光探針修飾為：5’-TAMRA，3’-MGB；

本發明還提供了一種檢測轉基因煙草多重熒光PCR的方法，所述轉基因煙草選自種子、新鮮煙葉、烤后卷煙或卷煙。

優選地，該方法包括以下步驟：

步驟1：進行樣品處理，提取樣品DNA；

步驟2：建立包括權利要求2所述引物探針的多重熒光PCR反應體系，反應條件為：95℃ 20-120s或10-15min；95℃ 5-60s，60℃ 20-120s，40個循環，收集熒光信號；

步驟3：煙草轉基因成分檢測結果的判斷。

優選地，所述步驟1具體為：

當所述樣品為種子和新鮮煙葉時，使用自檢工作站、核酸提取儀、試劑盒、CTAB法、SDS法提取樣品DNA；

當所述樣品為烤后煙葉和卷煙時，采用以下步驟提取樣品DNA：

樣品粉碎，加入正己烷和CTAB抽提液，混勻，靜止至水相和有機相明顯分層，離心，將水相和有機相明顯分層，取水相，將水相離心后取上清水相，提取DNA，再將DNA樣品濃縮以作后續檢測。

優選地，所述樣品粉碎后的質量為不小于10g；

所述正己烷的用量為與樣品體積相同；

所述CTAB抽提液的用量為20mL；

所述將水相和有機相離心的轉速不小于3k rpm，離心的時間不小于10min；

所述將水相離心的轉速不小于6k rpm，離心的時間不小于10min；

所述DNA樣品濃縮的體積為10–100μL。

多重熒光PCR儀上進行擴增和檢測的方法是選擇25μL或50μL體系進行反應體系的配制，分別配制針對Nr基因的單重反應體系A，針對CaMV35S、NPT II、NOS基因的三重反應體系B、針對Btc、CpTI、EPSPS基因的三重反應體系C，針對CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp基因的三重反應體系D，針對CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD基因的三重反應體系E，再設置反應條件，按判定條件進行結果判定。為便于理解判斷條件，先簡要闡述相關定義。

熒光信號檢測基因：體系A中FAM熒光信號檢測Nr基因，體系B中FAM、HEX、TAMRA熒光信號分別檢測CaMV35S、NPT II、NOS基因，體系C中FAM、HEX、TAMRA熒光信號分別檢測Btc、CpTI、EPSPS基因，體系D中FAM、HEX、TAMRA熒光信號分別檢測CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp基因，體系E中FAM、HEX、TAMRA熒光信號分別檢測CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD基因。

熒光信號檢測陽性：FAM或HEX或TAMRA有熒光對數增長且Ct值≤30.0；或30.0<Ct值<40.0且復檢后Ct值<40.0，此兩種情況均為該熒光信號檢測陽性。

熒光信號檢測陰性：FAM或HEX或TAMRA有熒光對數增長且Ct值≥40.0；或30.0<Ct值<40.0且復檢后Ct值≥40.0，此兩種情況均為該熒光信號檢測陰性。

優選地，所述步驟3的判斷方法具體為：

(1)質控標準：陽性對照的Nr、CaMV35S、NPT II、NOS、Btc、CpTI、EPSPS、CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp、CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD均有熒光對數增長，且Ct值≤30.0，陰性對照和空白對照均無熒光信號和熒光對數增長，Ct值≥40.0，進行(2)的煙草成分檢測；

(2)煙草成分檢測：樣品Nr檢測陰性，表明該樣品中不含煙草DNA，或煙草DNA含量不足以進行轉基因成分檢測和判定；樣品Nr檢測陽性，表明該樣品中含有煙草DNA，進行(3)的轉基因成分判定；

(3)轉基因成分判定：CaMV35S或/和NPT II或/和NOS檢測陰性，表明該樣品未檢出CaMV35S或/和NPT II或/和NOS轉基因成分；CaMV35S或/和NPT II或/和NOS檢測陽性，表明該樣品檢出CaMV35S或/和NPT II或/和NOS轉基因成分，進行(4)的品系鑒定；

(4)品系鑒定：Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD檢測陰性，表明該樣品含有Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD品系基因；Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD檢測陽性，表明該樣品含有Btc或/和CpTI或/和EPSPS或/和CMV-cp或/和PVY-cp或/和TMV-cp或/和CMV-sat或/和PVY-Nib或/和TMV-54kD品系基因。

可將反應體系A、B、C、D、E一并配制后按反應條件同時檢測，從而提高檢測效率；也可先配制反應體系A進行檢測，若結果為陽性再配制反應體系B進行檢測，若結果為陽性又配制反應體系C、D、E進行檢測，從而節省操作和試劑。

發明人根據當前文獻報道和標準制修訂情況及相關研究情況，篩選Nr基因為煙草內源基因，CaMV35S、NPT II、NOS為轉基因煙草的通用元件，檢測范圍可覆蓋當前絕大多數商業轉基因煙草及產品。在品系鑒定上，常見轉基因煙草性狀通常通過Btc、CpTI、EPSPS、CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp、CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD等一個或多個外源功能基因進行表達，本申請件就通過相應基因檢測進行品系鑒定。由于轉基因技術發展迅速、處于實驗研究中的轉基因煙草品系眾多，本發明通過采用上述內源基因、通用元件和功能基因相結合，有利于不同品系煙草轉基因成分的充分檢出。

此外，需要指出的是：本方法中陰性對照標明為非轉基因源性且非煙草源性DNA，如非轉基因動物DNA、除煙草外的非轉基因植物DNA等，來源廣泛、便于制備。但需要注意：CaMV35S、NPT II、NOS、Btc、CpTI、EPSPS、CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp、CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD等基因也是分別從自然界中的對應物種中獲得后應用于基因工程的，請勿故意使用上述對應物種DNA作為陰性對照，導致實驗失敗。

本發明還提供了一種檢測轉基因煙草多重熒光PCR的試劑盒，包括上述一種檢測轉基因煙草的多重熒光PCR引物提供的所述PCR引物、一種檢測轉基因煙草的多重熒光PCR探針提供的所述PCR探針、熒光PCR試劑、陽性對照、陰性對照和空白對照。

優選地，所述陽性對照為為上述多重熒光PCR引物可進行擴增且PCR探針能進行檢測的DNA片段，濃度為10⁵copies/μL級；

所述權利要求2所述的PCR探針的濃度均為10μmol/L；

所述權利要求1所述的PCR引物的濃度均為10μmol/L；

所述陰性對照為非轉基因源性且非煙草源性DNA；

所述空白對照為3d H2O。

從以上技術方案可以看出，本發明具有以下優點：

(1)本發明將煙草轉基因品系的內源和特定外源基因同時用于設計特異性的引物探針組，各引物探針不會造成相互干擾，僅能對特定目標序列進行擴增并激發熒光信號，對非目標序列無擴增和熒光信號，特異性好，檢測靈敏度高。

(2)本發明相對現有相關標準SN/T 1200-2003《煙草中轉基因成分定性PCR檢測方法》的普通PCR法、GB/T 24310-2009《煙草及煙草制品轉基因檢測方法》的熒光PCR法、普通PCR法、巢式PCR法、半巢式PCR法混用，統一為多重熒光PCR法同時檢測多個目的基因，提升檢測效率，且便于檢測人員實際運用。

(3)本發明根據Cry1Ab和Cry1Ac的融合基因Cry1A(b)/(c)即Btc基因設計引物探針，相對GB/T 24310-2009中Cry1Ac的覆蓋面更廣。此外，本發明中探針長度均在15-25bp正常范圍，相對GB/T 24310-2009中Nr基因探針40bp，特異性有一定提升。最后，選用無熒光的NFQ-MGB作為淬滅基團，相對有熒光的TAMRA特異性更強。

(4)本發明提供的檢測方法有利于不同品系煙草轉基因成分的充分檢出，相對多重PCR方法具有標準誤差更小(標準3kbp質粒初始濃度為10⁵級時，定量標準誤差在10⁴級)、檢測時間更短(上機1h左右出具檢測結果)、產生有毒有害物質更少(熒光染料用量為ng/μL級)的優點；相對熒光PCR方法具有同時檢測多個目標基因、節約試劑成本的優點；相對普通PCR方法，兼具上述兩種優點。

(5)本發明的試劑盒在選用適于多重熒光PCR引物體系的外購的試劑套裝時，選擇帶熱敏Taq抗體的型號，抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增，延長試劑盒保存時間、允許更多的凍融次數；所述熒光PCR試劑中包括ROX染料，對于需要ROX染料的多重熒光PCR儀可提升檢測準確性。

(6)本發明提供的引物、探針、試劑盒和方法已應用于本單位相關科研中(檢出限0.01％質量分數)，在另一家同行業檢測單位也已驗證通過，上百批次樣品無漏檢、誤檢情況，與標準方法檢測結果相同；實踐表明，本發明相對標準方法節約操作時間70％以上、節約試劑成本70％以上，具有較好的實用價值。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。

圖1為本發明實施例一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法的檢測結果圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

以下就本發明所提供的一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法做進一步說明。

本發明提供檢測煙草轉基因成分的多重熒光PCR引物探針組具體如表1所示：包括針對Nr基因的單重引物探針組，針對CaMV35S、NPT II、NOS基因的三重引物探針組、針對Btc、CpTI、EPSPS基因的三重引物探針組，針對CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp基因的三重引物探針組，針對CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD基因的三重引物探針組。

表1引物探針對照表

實施例一檢測煙草轉基因成分的多重熒光試劑盒的構建及驗證

(1)引物探針組：如表2所示，可通過具有引物和探針合成能力的公司合成，本實施例選擇上海生工生物工程技術服務有限公司合成，將引物和探針干粉稀釋至100μmol/L作為儲備液，按照表1配制成10μmol/L作為使用液。

表2 100μmol/L儲備液配制為10μmol/L使用液

*：分別用1.5mL透明離心管封裝；#：分別用1.5mL黑色離心管封裝。

(2)熒光PCR試劑：常見市售熒光PCR試劑，本實施例選擇 Path-ID^TMqPCR Master Mix。

(3)陽性對照：取全部引物儲備液，分別稀釋至10μmol/L。提取含有Nr、CaMV35S、NPT II、NOS、Btc、CpTI、EPSPS、CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp、CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD的轉基因煙草品系DNA，用對應引物和普通PCR試劑在普通PCR儀上進行擴增，將目的條帶切膠回收后轉入TaKaRa T-Vector pMD^TM 20載體，用感受態E.coli細胞JM109復制，提取pMT-20質粒，分別稀釋至10⁷copies/μL級濃度，各取1μL混勻后用3d H2O定容至100μL，終濃度即為10⁵copies/μL級。

(4)陰性對照：選擇非轉基因且非煙草源性DNA。

(5)空白對照：3d H2O。

(6)多通道熒光PCR儀選用ABI Quantstudio 5，驗證樣品特征如表3、按表4進行反應液配制、按表5進行反應。

表3樣品特征

表4 25μL反應體系(單位：μL)

表5反應條件

(7)反應結果如圖1和表6所示：

圖1中，曲線1至13、曲線14至26、曲線27至39、曲線40至52分別為陽性對照、陰性對照、加標對照、空白對照的Nr(FAM)、CaMV35S(FAM)、NPT II(HEX)、NOS(TAMRA)、Btc(FAM)、CpTI(HEX)、EPSPS(TAMRA)、CMV-cp(FAM)、PVY-cp(HEX)、TMV-cp(TAMRA)、CMV-sat(FAM)、PVY-Nib(HEX)、TMV-54kD(TAMRA)的熒光信號。

表6樣品檢測結果：實測Ct值及有無S型曲線

(8)驗證結果：與按照GB/T 24310-2009《煙草及煙草制品轉基因檢測方法》對樣品進行轉基因煙草成分檢測的結果相符。通過陽性對照、加標對照、陰性對照、空白對照的設置，表明試劑盒成分有效，且特異性好、標準誤差小、檢測時間短、節約試劑成本。

實施例二Btc/CpTI/EPSPS、CMV-cp/PVY-cp/TMV-cp、CMV-sat/PVY-Nib/TMV-54kD三種轉基因煙草品系樣品的檢測

從貴州省農科院獲贈Btc/CpTI/EPSPS、CMV-cp/PVY-cp/TMV-cp、CMV-sat/PVY-Nib/TMV-54kD三種轉基因煙草品系種子及新鮮煙葉，依次編為#1、#2、#3樣品。將樣品球磨粉碎后使用外購DNA提取試劑盒(QiagenMagAttract Hmw DNA kit)在小型磁力架(Qiagen MagAttract Magnetic Rack)上提取樣品DNA；DNA純度均為OD260/OD280＝1.79，濃度分別為182.7ng/μL、150.3ng/μL、194.6ng/μL，-20℃保存。之后將DNA分別稀釋至50ng/μL進行檢測，引物針組、陽性對照、陰性對照、空白對照等均按實施例一中的試劑盒成分，外購的熒光PCR試劑為 Multiplex PCR Kit，上機檢測(ABI熒光PCR儀，型號為Step one plus)。

檢測結果見表7和表8：

(1)質控標準：陽性對照的Nr、CaMV35S、NPT II、NOS、Btc、CpTI、EPSPS、CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp、CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD均有熒光對數增長，且Ct值≤30.0，陰性對照和空白對照均無熒光信號和熒光對數增長，Ct值≥40.0，可進行樣品成分檢測。

(2)所有樣品Nr檢測陽性，表明所有樣品中含有煙草DNA，可進行轉基因成分判定。

(3)所有樣品CaMV35S和NPT II和NOS陽性，表明所有樣品檢出CaMV35S和NPT II和NOS轉基因成分，可再進行品系鑒定。

(4)#1煙草樣品Btc(FAM)、CpTI(HEX)、EPSPS(TAMRA)檢測陽性，表明該樣品含有Btc、CpTI、EPSPS品系基因。

(5)#2煙草樣品CMV-cp(FAM)、PVY-cp(HEX)、TMV-cp(TAMRA)檢測陽性，表明該樣品含有CMV-cp、PVY-cp、TMV-cp品系基因。

(6)#3煙草樣品CMV-sat(FAM)、PVY-Nib(HEX)、TMV-54kD(TAMRA)檢測陽性，表明該樣品含有CMV-sat、PVY-Nib、TMV-54kD品系基因。

(7)比對結果：與按照GB/T 24310-2009《煙草及煙草制品轉基因檢測方法》對樣品進行轉基因煙草成分檢測的結果相符。

表7對照檢測結果：實測Ct值及有無S型曲線

表8樣品檢測結果：實測Ct值及有無S型曲線

實施例三非轉基因煙草品系樣品的檢測

從貴州省質檢院獲贈非轉基因煙草樣品(烤后煙葉粉末)。(1)樣品用球磨機粉碎，處理后質量10.0g；(2)加入10mL正己烷、20mL CTAB抽提液，在空氣搖床中120rpm、勻質6h，間或顛倒混勻；(3)10k rpm、10min離心使水相和有機相明顯分層，移去有機相并移取水相；(4)將所得水相10k rpm、10min離心，移取上清水相；(5)用大體積DNA提取試劑盒(Qiagen DNeasy Plant Maxi Kit)進行DNA提??；(6)再通過柱膜濃縮管(Millipore Microcon DNA fast flow(PCR grade))濃縮DNA樣品至10μL，DNA純度為OD260/OD280＝1.71、DNA濃度為8.60ng/μL，-20℃保存。

引物組、探針組、陽性對照、陰性對照、空白對照均按實施例一中的試劑盒成分，外購的熒光PCR試劑為ABI TaqMan^TM Environmental Master Mix2.0，上機檢測(ABI熒光PCR儀，型號為7500Fast)。

檢測結果見表9：

(2)樣品Nr檢測陽性，表明樣品中含有煙草DNA，可進行轉基因成分判定。

(3)樣品CaMV35S和NPT II和NOS陰性，表明所有樣品未檢出CaMV35S和NPT II和NOS轉基因成分，應為非轉基因煙草，無需再進行品系鑒定。

表9樣品檢測結果：實測Ct值及有無S型曲線

綜上所述，本發明提供的多重熒光PCR引物、探針、方法及試劑盒僅對煙草和轉基因煙草的目的基因進行特異性擴增，并在擴增中產生熒光信號，可有效適用于煙草相關產品的轉基因成分檢測，與相關標準檢測方法的結果相符，節約了檢測時間，降低了檢測成本，具有較好的實用價值。

以上所述，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的精神和范圍。

序列表

<110> 貴州中煙有限責任公司

<120> 一種轉基因煙草多重熒光PCR基因位點、引物及其檢測方法

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA