構建細胞全轉錄本擴增產物的方法及其應用與流程

文檔序號:18145642發布日期:2019-07-10 11:47
構建細胞全轉錄本擴增產物的方法及其應用與流程
本發明涉及生物
技術領域
,具體地,本發明涉及構建細胞全轉錄本擴增產物的方法及其應用,更具體地,本發明涉及構建細胞全轉錄本擴增產物的方法、檢測細胞中預定因子的方法、檢測細胞中預定因子的系統以及檢測前列腺癌循環腫瘤細胞中AR-V7的試劑盒。
背景技術
:前列腺癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一,在全球范圍內其發病率居男性惡性腫瘤的第2位,死亡率居第5位。近十年來,隨著我國人口老齡化和生活方式的改變,前列腺癌的發病率和死亡率呈明顯的逐年上升趨勢。雄激素受體(AR)在前列腺癌的發生、發展中起著重要作用,其通過調節下游基因的表達,促進前列腺癌的進展和轉移。晚期前列腺癌的治療方法主要是內分泌治療,即雄激素剝奪治療(ADT)。但在前列腺癌的治療過程中,常常對其產生耐藥,并發展成為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)。在CRPC中盡管雄激素水平被抑制,但AR信號通路在CRPC中仍起著至關重要的作用。AR-V7(androgenreceptorsplicevariant7)是AR-Vs(androgenreceptorsplicevariants)中的一種,結構類似于AR,但缺乏配體結合域,可以不依賴雄激素而持續地活化。Antonarakis等人探討了循環腫瘤細胞(CTC)中AR-V7的表達和CRPC患者對AR靶向療法的藥物恩雜魯胺或阿比特龍治療反應之間的相關性。研究結果顯示,恩雜魯胺治療組39%的患者和阿比特龍組19%的患者出現循環腫瘤細胞中AR-V7陽性。恩雜魯胺組AR-V7陽性患者與陰性患者相比,PSA(前列腺特異抗原)反應率明顯降低(0%VS53%,P=0.004),PSA無進展生存時間(1.4個月VS6個月,P<0.001),臨床或影像學無進展生存時間(2.1個月VS6.1個月)和總體生存時間都明顯縮短;阿比特龍組也出現相似的結果(AntonarakisES,LuC,WangH,etal.AR-V7andresistancetoenzalutamideandabirateroneinprostatecancer[J].NEnglJMed.2014,371(11):1028-1038.)。這說明AR-V7參與了恩雜魯胺和阿比特龍耐藥性的發展。目前已有大量研究證明,對前列腺癌循環腫瘤細胞AR-V7的檢測可以對CRPC患者中AR靶向療法的耐藥性進行評估。因此,如何快速、準確地檢測前列腺癌患者中循環腫瘤細胞(CTC)中的AR-V7,是指導前列腺癌患者用藥的關鍵問題。技術實現要素:本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。在本發明的第一方面,本發明提出了一種構建細胞全轉錄本擴增產物的方法。根據本發明的實施例,所述方法包括:將細胞樣品進行磁珠捕獲處理,以便獲得待處理細胞;以及將所述待處理細胞進行單細胞全轉錄本擴增,以便獲得所述待處理細胞的全轉錄本擴增產物,其中,進行單細胞全轉錄本擴增之前,進一步包括將所述待處理細胞進行裂解處理,所述裂解處理是通過向所述待處理細胞中加入PBS和裂解液進行的,基于1~100個待處理細胞,所述PBS的用量為7微升,所述裂解液的用量為4微升,所述裂解液包括100mMTris-HCl、500mMKCl、25mMMgCl2、10%NP40、0.1MDTT、RNA酶抑制劑(40U/μl)、0.5μMUP1引物、2.5mMdNTP以及無核酸酶水。根據本發明實施例的方法,將磁珠捕獲技術與單細胞全轉錄本擴增技術巧妙相結合,嚴格控制待處理細胞與裂解液和PBS的加入量,可穩定獲得微量細胞(如循環腫瘤細胞)全轉錄本擴增產物。根據本發明的實施例,上述方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一:根據本發明的實施例,所述細胞樣品來源于外周血。根據本發明的實施例,所述外周血為腫瘤患者外周血。根據本發明的實施例,所述待處理細胞為循環腫瘤細胞。根據本發明的實施例,所述裂解處理包括用移液器對所述待處理細胞進行吸打重懸處理至少5次。進而對待處理細胞的裂解處理更加徹底。根據本發明的實施例,所述磁珠捕獲處理是通過如下方式進行的:1)將5mL外周血與100μL磁珠進行第一混合,所述磁珠預先利用PBS進行第一重懸處理,所述第一混合是在5rpm的條件下進行30min;2)將所述第一混合產物在磁力架上靜置3min,以便除去第一上清;3)將步驟2)所得沉淀進行第二重懸處理,所述第二重懸處理是在5mlPBS中進行的;4)將第二重懸處理產物在磁力架上靜置1min,以便除去第二上清;5)重復步驟3)和4)兩次;6)將步驟5)所得沉淀進行第三重懸處理,所述第三重懸處理是在1mlPBS中進行的;7)將第三重懸處理產物在磁力架上靜置1分鐘,以便獲得所述循環腫瘤細胞;其中,所述磁珠包被有識別所述循環腫瘤細胞的抗體。根據本發明的具體實施例,所述抗體包括EpCAM、Her2的至少之一。進而腫瘤患者外周血中的循環腫瘤細胞在上述操作順序和操作條件下得到進一步地高效富集。根據本發明的實施例,所述單細胞全轉錄本擴增是通過如下方式獲得的:1)將循環腫瘤細胞在24℃的條件下進行裂解5分鐘,隨后在95℃的條件下裂解3分鐘,冷卻至4℃;2)將步驟1)獲得的裂解產物在磁力架上靜置1分鐘,吸取第三上清;3)將步驟2)所獲得第三上清與2μlgDNAWipeoutBuffer進行混合,所述混合是在42℃的條件下進行10分鐘;4)將步驟3)所獲得產物與6μlQuantiscriptRTmix進行混合,所述混合是在42℃的條件下進行60分鐘;5)將步驟4)所得產物在95℃的條件下孵育3分鐘,放冰上冷置;6)在步驟5)所得產物與10μl的ligationmix混合,所述混合是在24℃條件下進行30分鐘;7)將步驟6)所得產物在95℃條件下靜置5分鐘,放冰上冷置;8)將步驟7)所得產物與30μl的REPLI-gSensiPhiamplificationmix進行混合,所述混合是在30℃條件下進行2h;9)將步驟8)所得產物在65℃的條件下孵育5分鐘;10)將步驟9)所得產物進行純化處理,以便獲得所述循環腫瘤細胞全轉錄本擴增產物。進而所富集的循環腫瘤細胞在上述裂解條件下得到徹底裂解,循環腫瘤細胞中mRNA得到充分釋放,進一步依據上述的RNA反轉錄條件和操作,對單個細胞或有限的樣本進行高度均一的全轉錄本擴增(WTA),可均一的擴增單個細胞(1至100個細胞)或純化的總RNA,覆蓋全轉錄組,確保所得的RNA真實反映了體內的基因表達譜。利用上述操作方式下的單細胞轉錄組擴增技術對捕獲的CTC進行全轉錄本擴增,可提高CTC預定因子檢測的敏感性。在本發明的第二方面,本發明提出了一種檢測細胞中預定因子的方法。根據本發明的實施例,所述方法包括:按照前面所述的方法構建細胞全轉錄本擴增產物;以及基于所述全轉錄本擴增產物進行針對預定因子的PCR擴增,以便檢測所述細胞中預定因子。利用根據本發明實施例的上述方法,可高效檢測出微量細胞中的預定因子,檢測效率顯著提高。根據本發明的實施例,上述方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一:根據本發明的實施例,所述細胞為前列腺癌循環腫瘤細胞。根據本發明的實施例,所述預定因子為AR-V7。根據本發明的實施例的上述方法可對5ml血液中含有2個及以上的AR-V7陽性細胞進行檢出。根據本發明的實施例,所述PCR擴增為ddPCR擴增,ddPCR引物具有SEQIDNO:1~2所示的核苷酸序列。CAGCAGAAATGATTGCACTATTGAT(SEQIDNO:1)。CTGGTCATTTTGAGATGCTTGCAAT(SEQIDNO:2)。根據本發明的實施例,ddPCR擴增的探針具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。AATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTT(SEQIDNO:3)。根據本發明的實施例,ddPCR擴增的反應條件為進而,在上述ddPCR擴增條件下,對AR-V7的檢測效率進一步提高,根據本發明實施例的方法的準確度和可信度進一步提高。根據本發明的實施例,所述PCR擴增的引物具有SEQIDNO:1或4所示的核苷酸序列;CAGCAGAAATGATTGCACTATTGAT(SEQIDNO:1)。CCAGGTTTCTCCAGACTATCCAC(SEQIDNO:4)。根據本發明的實施例,PCR擴增的反應條件為進而,在上述PCR擴增條件下,對AR-V7的檢測效率進一步提高,根據本發明實施例的方法的準確度和可信度進一步提高。在本發明的第三方面,本發明提出了一種檢測細胞中預定因子的系統。根據本發明的實施例,所述系統包括:構建細胞全轉錄本擴增產物裝置,所述構建細胞全轉錄本擴增產物裝置用于構建細胞全轉錄本擴增產物,以及PCR擴增裝置,所述PCR擴增裝置與所述構建細胞全轉錄本擴增產物裝置相連,用于基于所述全轉錄本擴增產物進行針對預定因子的PCR擴增,以便檢測細胞中預定因子。根據本發明的具體實施例,所述構建細胞全轉錄本擴增產物裝置進一步包括:磁珠捕獲單元,所述磁珠捕獲單元用于捕獲細胞樣品中的待處理細胞;裂解單元,所述裂解單元與所述磁珠捕獲單元相連,用于將所述待處理細胞進行裂解處理,所述裂解處理是通過向所述待處理細胞中加入PBS和裂解液進行的,基于1~100個待處理細胞,所述PBS的用量為7微升,所述裂解液的用量為4微升,所述裂解液包括100mMTris-HCl、500mMKCl、25mMMgCl2、10%NP40、0.1MDTT、RNA酶抑制劑(40U/μl)、0.5μMUP1引物、2.5mMdNTP以及無核酸酶水;單細胞全轉錄本擴增單元,所述單細胞全轉錄本擴增單元與所述裂解單元相連,用于對裂解處理產物進行單細胞全轉錄本擴增,以便獲得細胞全轉錄本擴增產物。利用根據本發明實施例的上述系統,可高效檢測出微量細胞中的預定因子,檢測效率顯著提高。在本發明的第四方面,本發明提出了一種檢測前列腺癌循環腫瘤細胞中AR-V7的試劑盒。根據本發明的實施例,所述試劑盒包括:試劑,所述試劑包括核酸,所述核酸具有SEQIDNO:1~3所示的核苷酸序列。利用根據本發明實施例的試劑盒,可在微量樣品中實現AR-V7的高效檢測。根據本發明的實施例,上述試劑盒還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一:根據本發明的實施例,所述試劑進一步具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的核酸。利用根據本發明實施例的試劑盒,可在微量樣品中實現AR-V7的高效檢測。附圖說明圖1是根據本發明實施例的檢測細胞中預定因子的方法中CTC捕獲的流程示意圖;圖2是根據本發明實施例的檢測細胞中預定因子的方法中對捕獲的CTC進行全轉錄本擴增以及AR-V7檢測的流程示意圖。具體實施方式下面詳細描述本發明的實施例,所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的,旨在用于解釋本發明,而不能理解為對本發明的限制。下面描述的實施例利用AdnaTestProstateCancerSelectkit(Qiagen,395032)對前列腺癌患者血液進行CTC捕獲,利用單細胞RNA擴增的試劑盒REPLI-gWTASingleCellKit(Qiagen,150063)對捕獲的CTC進行裂解,得到的RNA進行反轉錄及cDNA擴增,設計AR-V7的ddPCR引物進行AR-V7檢測。實現了對5ml血液中含有2個及以上的AR-V7陽性細胞進行檢出。具體流程可參考圖1和圖2。實施例1、CTC捕獲利用AdnaTestProstateCancerSelectkit(Qiagen,395032)進行CTC捕獲。1)用移液器重懸ProstateSelectBeads1,不要渦旋振蕩。2)將磁珠(每個樣本100μL)加入1.5ml離心管中。超過10個樣本需要增加一個1.5ml離心管。3)將離心管置于磁力架上1分鐘,用移液器去除上清。4)加入1mlPBS反復吸打重懸磁珠。5)將離心管置于磁力架上1分鐘,用移液器去除上清。6)重復步驟4)-5)兩次(共三次)。7)將Beads懸浮于PBS中至原始體積(每個樣本100μl)。8)吸取5ml血液至15ml反應管中,加入100μL磁珠。9)在室溫下緩慢離心(混勻儀約5rpm)30分鐘。10)將反應管置于磁力架上3分鐘,用移液器去除上清,不要接觸到磁珠。11)加入5mlPBS,輕輕搖晃以重新懸浮Bead/Cell復合物。12)將反應管置于磁力架上1分鐘,用移液器去除上清,不要接觸到磁珠。13)重復步驟11)-12)(共三次)。14)加入1mlPBS重懸磁珠(輕搖混勻),轉移到1.5ml離心管中。15)將離心管置于磁力架上1分鐘,用移液器徹底去除上清。2、RNA反轉錄及擴增利用REPLI-gWTASingleCellKit(Qiagen,150063)進行RNA反轉錄及擴增。1)在離心管加入7μlPBS和4μl的LysisBuffer,用移液器吸打重懸至少5次。2)24℃孵育5分鐘,隨后95℃孵育3分鐘,冷卻至4℃。3)將離心管置于磁力架上1分鐘,用移液器轉移上清至新的離心管中。4)加入2μlgDNAWipeoutBuffer,混勻離心,42℃孵育10分鐘。5)按照表1配置QuantiscriptRTmix。表1:QuantiscriptRTmix成分體積RT/PolymeraseBuffer4μlOligodTPrimer1μlQuantiscriptRTEnzymeMix1μlTotalvolume6μl6)每個裂解的細胞樣本中加入新鮮配置的6μl的QuantiscriptRTmix,輕輕混勻后離心,42℃孵育60分鐘。7)95℃孵育3分鐘,放冰上冷置。8)按照表2配置ligationmix。表2:ligationmix成分體積LigaseBuffer8μlLigaseMix2μlTotalvolume10μl9)在第7)步的反應液中每個樣本加入新鮮配置的10μl的ligationmix,輕輕混勻后離心,24℃孵育30分鐘。10)95℃孵育5分鐘,放冰上冷置。11)按照表3準備REPLI-gSensiPhiamplificationmix。表3:REPLI-gSensiPhiamplificationmix成分體積REPLI-gscReactionBuffer29μlREPLI-gSensiPhiDNAPolymerase1μlTotalvolume30μl12)在第10)步的反應液中每個樣本加入新鮮配置的30μl的REPLI-gSensiPhiamplificationmix,輕輕混勻后離心,30℃孵育2h。13)65℃孵育5分鐘。14)純化cDNA與純化大概70kb的gDNA方法相同,用Qubit進行定量。3、AR-V7檢測利用微滴式PCR(ddPCR)儀器(QX200TMDropletDigitalTMPCR系統,Bio-Rad,1864001)對AR-V7進行檢測,檢測引物見表4。表4:AR-V7ddPCR檢測引物1)按照表5配置20μlddPCR探針法定量反應體系。表5:ddPCR反應體系成分體積/量ddPCRTMSupermixforProbes10μl引物按照表4反應濃度加入體系步驟2第14步獲得的cDNA產物30ngH2O補足總體積20μl2)將一個新的DG8cartridge放入holder中,注意缺口方向;將20ul反應液加入到DG8cartridge的中間一排。3)在DG8cartridge最底下一排8個孔中各加入70μl微滴生成油(DGOil)。4)用膠墊封口。5)將以上holder輕輕地平穩放置于微滴生成儀(QX200TMDropletGenerator)中,開始生成微滴,注意儀器上指示燈狀態,一般約2分鐘。6)生產的微滴(40ul)全部轉移到96孔板。7)將膜有紅線標記的一面(反光亮面)朝上置于96孔板上并固定好,用預熱好的PX1熱封儀對其進行封膜,推薦的運行程序為:180℃,10s,無需顛倒方向進行二次封膜;8)利用PCR儀按照如下反應條件進行擴增。9)利用ddPCRReader(QX200TMDropletReader)讀取AR-V7陽性微滴數據,1μl反應液可檢測10個以上陽性微滴。利用普通PCR儀器對AR-V7進行檢測,檢測引物見表6。表6:按照表7配置20μlddPCR反應體系。表7:PCR反應體系成分體積/量2xKAPAFastMultiplexMix2μl引物按照表6反應濃度加入體系步驟2第14步獲得的cDNA產物30ngH2O補足總體積20μl利用PCR儀按照如下反應條件進行擴增。利用Agilent2100Bioanalyzersystem對擴增產物進行檢測。對比例1操作方法同實施例,只是RNA反轉錄及擴增中只加入了4μl的LysisBuffer。發現,細胞裂解不充分,不能充分懸浮磁珠,所獲得的cDNA無法用于AR-V7檢測。對比例2操作方法同實施例,只是RNA反轉錄及擴增中加入了2μlPBS和4μl的LysisBuffer。發現細胞裂解不充分,不能充分懸浮磁珠,所獲得的cDNA無法用于AR-V7檢測。對比例3操作方法同實施例,只是RNA反轉錄及擴增中加入了13μlPBS和4μl的LysisBuffer。發現細胞裂解不充分,所獲得的cDNA無法用于AR-V7檢測。對比例4操作方法同實施例,只是AR-V7ddPCR檢測引物的反應濃度調整為900nM,如表8所示。表8:發現,改變反應濃度,ddPCR陽性微滴數量比實施例減少一半。對比例5操作方法同實施例,只是調整AR-V7ddPCR檢測引物和探針序列,調整后的序列如表9所示。表9:名稱序列(5’-3’)反應濃度AR-V7-F1CGGAAATGTTATGAAGCAGGGATGA500nMAR-V7-R1CCAGGTTTCTCCAGACTATCCAC500nM探針1[6FAM]TCTGGGAGAAAAATTCCG[BHQ1]250nM發現,改變引物和探針序列,ddPCR陽性微滴數量比實施例減少1/4。對比例6操作方法同實施例,只是調整AR-V7ddPCR檢測的擴增反應的退火溫度,調整后的反應條件如下所述:發現,改變退火溫度,ddPCR陽性微滴數量比實施例減少一半。在本說明書的描述中,參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外,在不相互矛盾的情況下,本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例,可以理解的是,上述實施例是示例性的,不能理解為對本發明的限制,本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。SEQUENCELISTING<110>北京蓮和醫學檢驗所有限公司<120>構建細胞全轉錄本擴增產物的方法及其應用<130>PIDC3176275<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>ddPCR引物<400>1cagcagaaatgattgcactattgat25<210>2<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>ddPCR引物<400>2ctggtcattttgagatgcttgcaat25<210>3<211>27<212>DNA<213>Artificial<220><223>ddPCR擴增的探針<400>3aattccgaaggaaaaattgtccatctt27<210>4<211>23<212>DNA<213>Artificial<220><223>PCR擴增的引物<400>4ccaggtttctccagactatccac23當前第1頁1 2 3 
再多了解一些
當前第1頁1 2 3 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
做爱视频