用于檢測耶式肺孢子菌的LAMP引物組合及其應用的制作方法

文檔序號:18145673發布日期:2019-07-10 11:47
用于檢測耶式肺孢子菌的LAMP引物組合及其應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種用于檢測耶式肺孢子菌的LAMP引物組合及其應用。



背景技術:

侵襲性真菌病(invasive fungal disease,IFD)又稱侵襲性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)、深部真菌感染(deep fungal infection,DFI),是指真菌侵入人體組織、血液,在其中生長和繁殖,引起炎癥反應,并導致組織損害、器官功能障礙的病理生理過程。近二三十年來,隨著實體器官和造血干細胞移植、腫瘤化療、免疫抑制劑等新技術在臨床中的廣泛應用,使侵襲性真菌病的發病率和病死率逐年升高,已日益成為導致住院患者死亡的主要原因之一。由于感染侵襲性真菌病多發于入住ICU,高齡,糖尿病,惡性血液系統疾病,念珠菌定植,侵襲性操作,應用抗菌藥物、糖皮質激素、免疫抑制劑等人群中,其機體免疫力低下,重癥死亡率高,因此對侵襲性真菌感染的早期檢測及確定感染菌種有極為重要的意義。

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)是由耶式肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,原名卡式肺孢子菌)引起的呼吸系統真菌感染。耶式肺孢子菌通常寄生在肺泡中,在免疫缺陷者、虛弱的早產兒或營養不良等免疫功能低下者中可能患病,是艾滋病患者最重要的機會性感染,也是艾滋病患者重要的致死原因。

現有的侵襲性真菌感染檢測方法主要包括常規檢查法和特殊檢查法兩種。其中常規檢查法主要包括:1)真菌顯微鏡檢,即直接涂片染色鏡檢;2)真菌培養鑒定;3)組織病理學檢查。特殊檢查法主要包括:1)血清學檢查;2)分子生物學檢查。其中常規檢查法仍被視為確診侵襲性真菌感染的基石,但其存在敏感度較低,操作繁復,陰性結果不能排除診斷,檢測周期較長(通常需要幾天到幾周的時間)等問題,而導致延誤病情及用藥,增加死亡率等;血清學檢測難以排除真菌某些屬的種間抗原抗體交叉反應從而導致誤判。相較前兩種方法,分子生物學技術具有高特異性和高準確性的優點,并可從基因水平闡明真菌種群之間和中內的分類學關系,因而在近年來越來越得到廣泛認可和應用。目前建立的相關分子學診斷方法有普通PCR方法、脈沖場凝膠電泳分型(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、限制性片段長度多態性分析(RFLP)、實時熒光定量PCR技術(RTFQ-PCR)等,其共有的問題是對實驗操作要求較高,檢測時間較長(2.5h-3h左右)。因此,建立快速準確的分子診斷方法,為臨床提供早期診療依據是解決現狀的關鍵。



技術實現要素:

本發明的目的是提供一種用于檢測耶式肺孢子菌的LAMP引物組合及其應用。

本發明首先提供引物組合,由引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB組成;

所述引物F3為如下(a1)或(a2):

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子;

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子;

所述引物B3為如下(a3)或(a4):

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子;

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子;

所述引物FIP為如下(a5)或(a6):

(a5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子;

(a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子;

所述引物BIP為如下(a7)或(a8):

(a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子;

(a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子;

所述引物LF為如下(a9)或(a10):

(a9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子;

(a10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子;

所述引物LB為如下(a11)或(a12):

(a11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子;

(a12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合的用途為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):

(b1)鑒定待測菌是否為耶式肺孢子菌;

(b2)制備用于鑒定待測菌是否為耶式肺孢子菌的試劑盒;

(b3)檢測待測樣本中是否含有耶式肺孢子菌;

(b4)制備用于檢測待測樣本中是否含有耶式肺孢子菌的試劑盒。

本發明還保護所述引物組合的應用,為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):

(b1)鑒定待測菌是否為耶式肺孢子菌;

(b2)制備用于鑒定待測菌是否為耶式肺孢子菌的試劑盒;

(b3)檢測待測樣本中是否含有耶式肺孢子菌;

(b4)制備用于檢測待測樣本中是否含有耶式肺孢子菌的試劑盒。

本發明還保護含有所述引物組合的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2):

(c1)鑒定待測菌是否為耶式肺孢子菌;

(c2)檢測待測樣本中是否含有耶式肺孢子菌。

本發明還保護所述試劑盒的制備方法,包括將各條引物單獨包裝的步驟。

本發明還保護鑒定待測菌是否為耶式肺孢子菌的方法,包括如下步驟:以待測菌的基因組DNA為模板,采用所述引物組合進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組組合可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測菌為或候選為耶式肺孢子菌;如果采用所述引物組合不能實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測菌為非耶式肺孢子菌。

本發明還保護鑒定待測菌是否為耶式肺孢子菌的方法,包括如下步驟:檢測待測菌基因組DNA中是否含有所述引物組合的靶序列,如果所述基因組DNA中含有所述引物組合的靶序列,待測菌為或候選為耶式肺孢子菌;如果所述基因組DNA中不含有所述引物組合的靶序列,待測菌為非耶式肺孢子菌。

本發明還保護檢測待測樣本中是否含有耶式肺孢子菌的方法,包括如下步驟:以待測樣本的總DNA為模板,采用所述引物組合進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組合可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有耶式肺孢子菌;如果采用所述引物組合不能實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中不含有耶式肺孢子菌。

本發明還保護檢測待測樣本中是否含有耶式肺孢子菌的方法,包括如下步驟:檢測待測樣本的總DNA中是否含有所述引物組合的靶序列,如果所述總DNA中含有所述引物組合的靶序列,待測樣本中含有耶式肺孢子菌;如果所述總DNA中不含有所述引物組合的靶序列,待測樣本中不含有耶式肺孢子菌。

以上任一所述方法中,所述環介導等溫擴增的反應體系中引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,環介導等溫擴增反應條件為:65℃恒溫50min。

以上任一所述待測待測菌具體可為耶式肺孢子菌、煙曲霉、土曲霉、新型隱球菌或加特隱球菌。所述煙曲霉具體可為CGMCC,菌株編號:3.08027的煙曲霉。所述土曲霉具體可為CGMCC,菌株編號:3.08115的土曲霉。所述新型隱球菌具體可為ATCC,菌株號:208821的新型隱球菌。所述加特隱球菌可為ATCC,菌株號:14248的加特隱球菌。

以上任一所述待測樣本具體可為人(Homo sapiens)的肺泡灌洗液。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展出的一種敏感、特異、簡便、快捷的核酸擴增技術,其原理是在一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下,識別6-8個區域的4-6條引物,在等溫條件下快速、特異地擴增目的基因,可推廣應用于快速、準確的檢測常見的碳青霉烯類耐藥基因。LAMP方法具有靈敏性高、特異性好、反應時間短、判定結果方便、不需要昂貴儀器等優勢。

本發明提供的引物組合鑒定用于檢測常見的六種曲霉菌,具有高特異性和高靈敏度,可以實現簡便、快速、準確檢測。本發明具有重大的推廣價值。

附圖說明

圖1為實施例1中采用引物組Ⅰ的檢測結果。

圖2為實施例1中采用引物組Ⅱ的檢測結果。

圖3為實施例1中采用引物組Ⅲ的檢測結果。

圖4為實施例1中采用引物組Ⅳ的檢測結果。

圖5為實施例1中采用引物組Ⅴ的檢測結果。

圖6實施例2的檢測結果。

圖7為實施例3中反應體系1的檢測結果。

圖8為實施例3中反應體系2的檢測結果。

圖9為實施例3中反應體系3的檢測結果。

圖10為實施例3中反應體系4的檢測結果。

圖11為實施例4的檢測結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。

反應液為博奧生物集團有限公司產品,產品目錄號為CP.440020。

DNA拷貝數的計算方法如下:

1A260吸光度值=ds DNA 50μg/ml;

核酸濃度=(OD260)×(稀釋倍數)×(50)=x ng/μl;

平均分子量(MW)代表克/摩爾,單位道爾頓(dolton),即1dolton=1g/mol;

摩爾=6.02×1023;

平均分子量(MW):dsDNA=(堿基數)×(660道爾頓/堿基);

拷貝數計算公式:

(6.02×1023copies/摩爾)×(xng/μl×10-9)/(DNA長度×660)=copies/μl。

實施例1、引物組合的篩選制備

一、引物組合的篩選

1、針對耶式肺孢子菌設計若干引物組合,其中五個引物組合如下:

用于檢測耶式肺孢子菌引物組合Ⅰ如下(5’→3’):

引物Ⅰ-F3:TTCAACTATTTCTCCAGA;

引物Ⅰ-B3:TGCCACTGTAATTTCC;

引物Ⅰ-FIP:CGTCAAAAATAGACTTTGGTTGCAATACTGAACGGCCACCA;

引物Ⅰ-BIP:AATTTTTTTCTTGGTACCCAGGACCCATGTAACAACATAAGG;

引物Ⅰ-LF:TGAGTTACATTCTCAAA;

引物Ⅰ-LB:AGTTTCCCACATAT。

用于檢測耶式肺孢子菌引物組合Ⅱ如下(5’→3’):

引物Ⅱ-F3:AGCTGGTACATATGCA;

引物Ⅱ-B3:ATTCTCCAACATAAGCAA;

引物Ⅱ-FIP:AGCGAATGTCCTTTATACTGGAAAAACTTTATCAGCAATAGTTGA;

引物Ⅱ-BIP:GCTATGCCTCATCATATGTCTTCAGTTGTACTTGGAAGAGAAAC;

引物Ⅱ-LF:TGTATAAGTATAATTACCAGT;

引物Ⅱ-LB:TGACAATATTACAGCATCT。

用于檢測耶式肺孢子菌引物組合Ⅲ如下(5’→3’):

引物Ⅲ-F3:ATTTATTTAGGGCTATAAGT;

引物Ⅲ-B3:ATACACAAGATACCATGCT;

引物Ⅲ-FIP:CCTTTCCAACCATCGTTAATAGTATTCGAACACCATCATT;

引物Ⅲ-BIP:AAATCTGGCTATTTCAAAACCAAGACCCGTTATCAAGATATT;

引物Ⅲ-LF:TTTGTTATCCCATTCAC;

引物Ⅲ-LB:TATGATTTCTTTTCAAG。

用于檢測耶式肺孢子菌引物組合Ⅳ如下(5’→3’):

引物Ⅳ-F3:ATCAGCTGGTACATATG;

引物Ⅳ-B3:CTCCAACATAAGCAACC;

引物Ⅳ-FIP:AGCGAATGTCCTTTATACTGGAAAACAATAGTTGATGGCA;

引物Ⅳ-BIP:GCCTCATCATATGTCTTCAGTTGTACTTGGAAGAGAAACGT;

引物Ⅳ-LF:TATCAAATGTATAAGTAT;

引物Ⅳ-LB:TTTGACAATATTACAGC。

用于檢測耶式肺孢子菌引物組合Ⅴ如下(5’→3’):

引物Ⅴ-F3:TTTAATACGAGATGTTGCA;

引物Ⅴ-B3:GGCATTATCACCGATTGT;

引物Ⅴ-FIP:GCCCAAGAATGTCCAGTAAACCAAGTTCATGATTCTTATTTTCC;

引物Ⅴ-BIP:GGTATATTTGAGTCGCCTGACGGAATCCCAAAAAGCTTCATTGC;

引物Ⅴ-LF:TCAAAGGAGCGAAAA;

引物Ⅴ-LB:AGACGAAGAATCTTCAT。

上述的引物組合中,各單鏈DNA均各自獨立包裝。

上述的引物組合中,引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB的摩爾比均為0.5:0.5:2:2:1:1。

2、以耶式肺孢子菌檢測基因質粒DNA為模板,分別采用步驟1制備的引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ和引物組Ⅴ對模板進行環介導等溫擴增檢測。

耶式肺孢子菌檢測基因質粒:在pUC57質粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位點插入Genebank號為KM056674.1的DNA分子,得到重組質粒,該質粒即為耶式肺孢子菌檢測基因質粒。

反應體系(10μL):7.0μL反應液(博奧生物集團有限公司產品,產品目錄號:CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg),補水至10μL。引物混合物即引物組合中的各條引物組成的混合物。反應體系中,引物F3和引物B3的終濃度均為0.5μM,引物FIP和引物BIP的終濃度均為2μM,引物LF和引物LB的終濃度均為1μM。

反應條件:65℃恒溫50min。

反應過程中,采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

每個反應體系設置20次重復。

如果在50min內出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量可以被檢測出來。如果在50min內沒有出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量不能被檢測出來。

采用引物組Ⅰ的檢測結果見圖1。采用引物組Ⅱ的檢測結果見圖2。采用引物組Ⅲ的檢測結果見圖3。采用引物組Ⅳ的檢測結果見圖4。采用引物組Ⅴ的檢測結果見圖5。

結果顯示,引物組合Ⅲ的20個重復性好,其它四個引物組合由于在引物設計時引物間距、退火溫度等原因致使檢測重復性較差,故選擇組合Ⅲ作為檢測耶式肺孢子菌的引物組合。

二、引物組合的制備

用于檢測耶式肺孢子菌引物組合如下(5’→3’):

引物F3(序列1):ATTTATTTAGGGCTATAAGT;

引物B3(序列2):ATACACAAGATACCATGCT;

引物FIP(序列3):CCTTTCCAACCATCGTTAATAGTATTCGAACACCATCATT;

引物BIP(序列4):AAATCTGGCTATTTCAAAACCAAGACCCGTTATCAAGATATT;

引物LF(序列5):TTTGTTATCCCATTCAC;

引物LB(序列6):TATGATTTCTTTTCAAG。

引物組合中,各單鏈DNA各自獨立包裝。

引物組合中,引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB的摩爾比為0.5:0.5:2:2:1:1。

實施例2、特異性

一、待測樣本的制備

待測樣本1:煙曲霉(CGMCC,菌株編號:3.08027)基因組DNA;

待測樣本2:土曲霉(CGMCC,菌株編號:3.08115)基因組DNA;

待測樣本3:新型隱球菌(ATCC,菌株號:208821)基因組DNA;

待測樣本4:加特隱球菌(ATCC,菌株號:14248)基因組DNA;

待測樣本5:耶式肺孢子菌檢測基因質粒DNA;耶式肺孢子菌檢測基因質粒:在pUC57質粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位點插入Genebank號為KM056674.1的DNA分子,得到重組質粒,該質粒即為耶式肺孢子菌檢測基因質粒。

二、待測樣本的檢測

以步驟一中的各待測樣本為模板,采用實施例1步驟二制備的引物組合進行環介導等溫擴增。

反應體系(10μL):7.0μL反應液(博奧生物集團有限公司產品,其產品目錄號為CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg),補水至10μL。引物混合物即引物組合中的各條引物組成的混合物。反應體系中,引物F3和引物B3的終濃度均為0.5μM,引物FIP和引物BIP的終濃度均為2μM,引物LF和引物LB的終濃度均為1μM。

反應條件:65℃恒溫50min。

反應過程中,采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

每個反應體系設置20次重復。

結果見圖6。結果表明,只有當待測樣本為耶式肺孢子菌質粒DNA(待測樣本5)的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線)。當待測樣本為待測樣本1、2、3、4的時候均不顯示陽性擴增曲線。

以上結果表明,本發明提供的引物組合對其靶標基因有很高的特異性。

實施例3、靈敏性

待測樣本:耶式肺孢子菌檢測基因質粒DNA;耶式肺孢子菌檢測基因質粒:在pUC57質粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位點插入Genebank號為KM056674.1的DNA分子,得到重組質粒,該質粒即為耶式肺孢子菌檢測基因質粒。

1、將待測樣本用無菌水進行梯度稀釋,得到各個稀釋液。

2、以步驟1得到的稀釋液為模板,采用實施例1步驟二制備的引物組合進行環介導等溫擴增。

反應體系(10μL):7.0μL反應液(博奧生物集團有限公司產品,其產品目錄號為CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀釋液,補水至10μL。引物混合物即引物組合中的各條引物組成的混合物。反應體系中,引物F3和引物B3的終濃度均為0.5μM,引物FIP和引物BIP的終濃度均為2μM,引物LF和引物LB的終濃度均為1μM。

反應條件:65℃恒溫50min。

反應過程中,采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

根據稀釋液中基因組拷貝數的不同,共如下4個反應體系:

反應體系1:1μL稀釋液中含有的基因組拷貝數分別為103;

反應體系2:1μL稀釋液中含有的基因組拷貝數分別為5×102;

反應體系3:1μL稀釋液中含有的基因組拷貝數分別為102;

反應體系4:1μL稀釋液中含有的基因組拷貝數分別為101。

每個反應體系設置20次重復。

結果見圖7-圖10。引物組合檢測靶標基因在1μL稀釋液中基因組拷貝數為103(圖7)和5×102(圖8)時20個檢測均可檢測出來且重復性好,102(圖9)和101(圖10)時20個檢測不可完全出峰且重復性較差,因此引物組合的靈敏度為5×102個拷貝數/反應體系。

實施例4、臨床樣本檢測

待測樣本:已測序鑒定確認含有耶式肺孢子菌的人的肺泡灌洗液。

1、提取待測樣本的總DNA。

2、以步驟1提取的總DNA為模板,采用實施例1步驟二制備的引物組合進行環介導等溫擴增。

反應體系與反應條件均同實施例2。

反應過程中,采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

結果見圖11。結果顯示得到陽性擴增曲線,表明采用本發明的引物組合可以對臨床樣本中的耶式肺孢子菌進行檢測。

結果表明,利用本發明提供的耶式肺孢子菌引物組合可以進行耶式肺孢子菌檢測,結果準確可靠。

<110> 博奧生物集團有限公司

<120> 用于檢測耶式肺孢子菌的LAMP引物組合及其應用

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atttatttag ggctataagt 20

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<212> DNA

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aaatctggct atttcaaaac caagacccgt tatcaagata tt 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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