用于檢測六種曲霉的LAMP引物組合及其應用的制作方法

文檔序號:18145672發布日期:2019-07-10 11:47

技術特征:

1.引物組合,由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ和引物組Ⅵ組成;

所述引物組Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB組成;

所述引物Ⅰ-F3為如下(a1)或(a2):

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子;

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-B3為如下(a3)或(a4):

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子;

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-FIP為如下(a5)或(a6):

(a5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子;

(a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-BIP為如下(a7)或(a8):

(a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子;

(a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LF為如下(a9)或(a10):

(a9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子;

(a10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LB為如下(a11)或(a12):

(a11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子;

(a12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB組成;

所述引物Ⅱ-F3為如下(b1)或(b2):

(b1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子;

(b2)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-B3為如下(b3)或(b4):

(b3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子;

(b4)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-FIP為如下(b5)或(b6):

(b5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子;

(b6)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-BIP為如下(b7)或(b8):

(b7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子;

(b8)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LF為如下(b9)或(b 10):

(b9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子;

(b10)將序列11經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LB為如下(b11)或(b12):

(b11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子;

(b12)將序列12經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB組成;

所述引物Ⅲ-F3為如下(c1)或(c2):

(c1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子;

(c2)將序列13經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-B3為如下(c3)或(c4):

(c3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子;

(c4)將序列14經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-FIP為如下(c5)或(c6):

(c5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子;

(c6)將序列15經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-BIP為如下(c7)或(c8):

(c7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子;

(c8)將序列16經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LF為如下(c9)或(c10):

(c9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子;

(c10)將序列17經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LB為如下(c11)或(c12):

(c11)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子;

(c12)將序列18經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB組成;

所述引物Ⅳ-F3為如下(d1)或(d2):

(d1)序列表的序列19所示的單鏈DNA分子;

(d2)將序列19經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-B3為如下(d3)或(d4):

(d3)序列表的序列20所示的單鏈DNA分子;

(d4)將序列20經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-FIP為如下(d5)或(d6);

(d5)序列表的序列21所示的單鏈DNA分子;

(d6)將序列21經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-BIP為如下(d7)或(d8):

(d7)序列表的序列22所示的單鏈DNA分子;

(d8)將序列22經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LF為如下(d9)或(d10):

(d9)序列表的序列23所示的單鏈DNA分子;

(d10)將序列23經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LB為如下(d11)或(d12):

(d11)序列表的序列24所示的單鏈DNA分子;

(d12)將序列24經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB組成;

所述引物Ⅴ-F3為如下(e1)或(e2):

(e1)序列表的序列25所示的單鏈DNA分子;

(e2)將序列25經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列25具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-B3為如下(e3)或(e4):

(e3)序列表的序列26所示的單鏈DNA分子;

(e4)將序列26經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列26具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-FIP為如下(e5)或(e6):

(e5)序列表的序列27所示的單鏈DNA分子;

(e6)將序列27經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列27具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-BIP為如下(e7)或(e8):

(e7)序列表的序列28所示的單鏈DNA分子;

(e8)將序列28經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列28具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LF為如下(e9)或(e10):

(e9)序列表的序列29所示的單鏈DNA分子;

(e10)將序列29經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列29具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LB為如下(e11)或(e12):

(e11)序列表的序列30所示的單鏈DNA分子;

(e12)將序列30經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列30具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅵ由引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB組成;

所述引物Ⅵ-F3為如下(f1)或(f2):

(f1)序列表的序列31所示的單鏈DNA分子;

(f2)將序列31經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列31具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-B3為如下(f3)或(f4):

(f3)序列表的序列32所示的單鏈DNA分子;

(f4)將序列32經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列32具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-FIP為如下(f5)或(f6):

(f5)序列表的序列33所示的單鏈DNA分子;

(f6)將序列33經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列33具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-BIP為如下(f7)或(f8):

(f7)序列表的序列34所示的單鏈DNA分子;

(f8)將序列34經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列34具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LF為如下(f9)或(f10):

(f9)序列表的序列35所示的單鏈DNA分子;

(f10)將序列35經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列35具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LB為如下(f11)或(f12):

(f11)序列表的序列36所示的單鏈DNA分子;

(f12)將序列36經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列36具有相同功能的DNA分子。

2.權利要求1所述引物組合的應用,為如下(g1)-(g6)中的任意一種:

(g1)鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(g2)制備用于鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的試劑盒;

(g3)鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(g4)制備用于鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的試劑盒;

(g5)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus;

(g6)制備用于檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的試劑盒。

3.含有權利要求1所述引物組合的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(h1)或(h2)或(h3):

(h1)鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(h2)鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(h3)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus。

4.權利要求3所述試劑盒的制備方法,包括將各條引物單獨包裝的步驟。

5.鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的方法,為方法A或方法B;

所述方法A包括如下步驟:以待測曲霉的基因組DNA為模板,分別采用權利要求1所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組Ⅰ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為煙曲霉;如果采用所述引物組Ⅱ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為土曲霉;如果采用所述引物組Ⅲ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為構巢曲霉;如果采用所述引物組Ⅳ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為黃曲霉;如果采用所述引物組Ⅴ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為黑曲霉;如果采用所述引物組Ⅵ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為Aspergillus calidoustus;

所述方法B包括如下步驟:檢測待測曲霉基因組DNA中是否含有權利要求1所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ的靶序列,如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅰ的靶序列,待測曲霉為或候選為煙曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅱ的靶序列,待測曲霉為或候選為土曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅲ的靶序列,待測曲霉為或候選為構巢曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅳ的靶序列,待測曲霉為或候選為黃曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅴ的靶序列,待測曲霉為或候選為黑曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅵ的靶序列,待測曲霉為或候選為Aspergillus calidoustus。

6.鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的方法,為方法C或方法D;

所述方法C包括如下步驟:以待測微生物的基因組DNA為模板,分別采用權利要求1所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組Ⅰ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為煙曲霉;如果采用所述引物組Ⅱ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為土曲霉;如果采用所述引物組Ⅲ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為構巢曲霉;如果采用所述引物組Ⅳ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為黃曲霉;如果采用所述引物組Ⅴ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為黑曲霉;如果采用所述引物組Ⅵ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為Aspergillus calidoustus,如果采用引物對Ⅰ至引物組Ⅵ均不能實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為非煙曲霉且非土曲霉且非構巢曲霉且非黃曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus;

所述方法D包括如下步驟:檢測待測微生物基因組DNA中是否含有權利要求1所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ的靶序列,如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅰ的靶序列,待測微生物為或候選為煙曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅱ的靶序列,待測微生物為或候選為土曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅲ的靶序列,待測微生物為或候選為構巢曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅳ的靶序列,待測微生物為或候選為黃曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅴ的靶序列,待測微生物為或候選為黑曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅵ的靶序列,待測微生物為或候選為Aspergillus calidoustus;如果所述基因組DNA中不含有所述引物組Ⅰ至引物組Ⅵ中任一引物組的靶序列,待測微生物為非煙曲霉且非土曲霉且非構巢曲霉且非黃曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus。

7.檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的方法,為方法E或方法F;

所述方法E包括如下步驟:以待測樣本的總DNA為模板,分別采用權利要求1所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組Ⅰ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有煙曲霉;如果采用所述引物組Ⅱ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有土曲霉;如果采用所述引物組Ⅲ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有構巢曲霉;如果采用所述引物組Ⅳ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有黃曲霉;如果采用所述引物組Ⅴ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有黑曲霉;如果采用所述引物組Ⅵ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有Aspergillus calidoustus;如果采用引物對Ⅰ至引物組Ⅵ均不能實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中不含有煙曲霉且不含有土曲霉且不含有構巢曲霉且不含有黃曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus;

所述方法F包括如下步驟:檢測待測樣本總DNA中是否含有權利要求1所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ的靶序列,如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅰ的靶序列,待測樣本中含有煙曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅱ的靶序列,待測樣本中含有土曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅲ的靶序列,待測樣本中含有構巢曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅳ的靶序列,待測樣本中含有黃曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅴ的靶序列,待測樣本中含有黑曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅵ的靶序列,待測樣本中含有Aspergillus calidoustus;如果所述總DNA中不含有所述引物組Ⅰ至引物組Ⅵ中任一引物組的靶序列,待測樣本中不含有煙曲霉且不含有土曲霉且不含有構巢曲霉且不含有黃曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus。

8.權利要求1中所述的引物組Ⅰ或引物組Ⅱ或引物組Ⅲ或引物組Ⅳ或引物組Ⅴ或引物組Ⅵ。

9.權利要求1中所述的引物組Ⅰ在制備試劑盒A中的應用,或,所述引物組Ⅱ在制備試劑盒B中的應用,或,所述引物組Ⅲ在制備試劑盒C中的應用,或,所述引物組Ⅳ在制備試劑盒D中的應用,或,所述引物組Ⅴ在制備試劑盒E中的應用,或,所述引物組Ⅵ在制備試劑盒F中的應用;

所述試劑盒A的用途為如下(i1)或(i2):

(i1)鑒定待測微生物是否為煙曲霉;

(i2)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉;

所述試劑盒B的用途為如下(i3)或(i4):

(i3)鑒定待測微生物是否為土曲霉;

(i4)檢測待測樣本中是否含有土曲霉;

所述試劑盒C的用途為如下(i5)或(i6):

(i5)鑒定待測微生物是否為構巢曲霉;

(i6)檢測待測樣本中是否含有構巢曲霉;

所述試劑盒D的用途為如下(i7)或(i8):

(i7)鑒定待測微生物是否為黃曲霉;

(i8)檢測待測樣本中是否含有黃曲霉;

所述試劑盒E的用途為如下(i9)或(i10):

(i9)鑒定待測微生物是否為黑曲霉;

(i10)檢測待測樣本中是否含有黑曲霉;

所述試劑盒F的用途為如下(i11)或(i12):

(i11)鑒定待測微生物是否為Aspergillus calidoustus;

(i12)檢測待測樣本中是否含有Aspergillus calidoustus。

10.含有權利要求1中所述的引物組Ⅰ的試劑盒A,或,含有所述引物組Ⅱ的試劑盒B,或,含有所述引物組Ⅲ的試劑盒C,或,含有所述引物組Ⅳ的試劑盒D,或,含有所述引物組Ⅴ的試劑盒E,或,含有所述引物組Ⅵ的試劑盒F;

所述試劑盒A的用途為如下(i1)或(i2):

(i1)鑒定待測微生物是否為煙曲霉;

(i2)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉;

所述試劑盒B的用途為如下(i3)或(i4):

(i3)鑒定待測微生物是否為土曲霉;

(i4)檢測待測樣本中是否含有土曲霉;

所述試劑盒C的用途為如下(i5)或(i6):

(i5)鑒定待測微生物是否為構巢曲霉;

(i6)檢測待測樣本中是否含有構巢曲霉;

所述試劑盒D的用途為如下(i7)或(i8):

(i7)鑒定待測微生物是否為黃曲霉;

(i8)檢測待測樣本中是否含有黃曲霉;

所述試劑盒E的用途為如下(i9)或(i10):

(i9)鑒定待測微生物是否為黑曲霉;

(i10)檢測待測樣本中是否含有黑曲霉;

所述試劑盒F的用途為如下(i11)或(i12):

(i11)鑒定待測微生物是否為Aspergillus calidoustus;

(i12)檢測待測樣本中是否含有Aspergillus calidoustus。

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