用于檢測六種曲霉的LAMP引物組合及其應用的制作方法

文檔序號:18145672發布日期:2019-07-10 11:47
用于檢測六種曲霉的LAMP引物組合及其應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種用于檢測六種曲霉的LAMP引物組合及其應用。



背景技術:

侵襲性真菌病(invasive fungal disease,IFD)又稱侵襲性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)、深部真菌感染(deep fungal infection,DFI),是指真菌侵入人體組織、血液,在其中生長和繁殖,引起炎癥反應,并導致組織損害、器官功能障礙的病理生理過程。近二三十年來,隨著實體器官和造血干細胞移植、腫瘤化療、免疫抑制劑等新技術在臨床中的廣泛應用,使侵襲性真菌病的發病率和病死率逐年升高,已日益成為導致住院患者死亡的主要原因之一。由于感染侵襲性真菌病多發于入住ICU,高齡,糖尿病,惡性血液系統疾病,念珠菌定植,侵襲性操作,應用抗菌藥物、糖皮質激素、免疫抑制劑等人群中,其機體免疫力低下,重癥死亡率高,因此對侵襲性真菌感染的早期檢測及確定感染菌種有極為重要的意義。

曲霉菌病通常由曲霉(Aspergillus)導致,經常導致人肺部疾病或損害免疫系統。曲霉菌的孢子約2-5μM大小,易懸浮在空氣中。多數人吸入孢子并不會感染疾病,但免疫能力低下或有肺部疾病的患者具有更高的感染率,引起感染或繼發感染,如過敏性支氣管曲霉菌病、過敏性曲霉鼻竇炎、曲霉瘤、慢性肺曲霉病、侵入性曲霉病、皮膚曲霉病等。2011年劉又寧等對中國1998年至2007年臨床確診的肺真菌病患者的多中心回顧性調查顯示肺曲霉病為37.9%,排第一位。

現有的侵襲性真菌感染檢測方法主要包括常規檢查法和特殊檢查法兩種。其中常規檢查法主要包括:1)真菌顯微鏡檢,即直接涂片染色鏡檢;2)真菌培養鑒定;3)組織病理學檢查。特殊檢查法主要包括:1)血清學檢查;2)分子生物學檢查。其中常規檢查法仍被視為確診侵襲性真菌感染的基石,但其存在敏感度較低,操作繁復,陰性結果不能排除診斷,檢測周期較長(通常需要幾天到幾周的時間)等問題,而導致延誤病情及用藥,增加死亡率等;血清學檢測難以排除真菌某些屬的種間抗原抗體交叉反應從而導致誤判。相較前兩種方法,分子生物學技術具有高特異性和高準確性的優點,并可從基因水平闡明真菌種群之間和中內的分類學關系,因而在近年來越來越得到廣泛認可和應用。目前建立的相關分子學診斷方法有普通PCR方法、脈沖場凝膠電泳分型(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、限制性片段長度多態性分析(RFLP)、實時熒光定量PCR技術(RTFQ-PCR)等,其共有的問題是對實驗操作要求較高,檢測時間較長(2.5h-3h)左右。因此,建立快速準確的分子診斷方法,為臨床提供早期診療依據是解決現狀的關鍵。



技術實現要素:

本發明的目的是提供一種用于檢測六種曲霉的LAMP引物組合及其應用。

本發明首先提供了引物組合,由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ和引物組Ⅵ組成;

所述引物組Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB組成;

所述引物Ⅰ-F3為如下(a1)或(a2):

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子;

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-B3為如下(a3)或(a4):

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子;

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-FIP為如下(a5)或(a6):

(a5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子;

(a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-BIP為如下(a7)或(a8):

(a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子;

(a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LF為如下(a9)或(a10):

(a9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子;

(a10)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅰ-LB為如下(a11)或(a12):

(a11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子;

(a12)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB組成;

所述引物Ⅱ-F3為如下(b1)或(b2):

(b1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子;

(b2)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-B3為如下(b3)或(b4):

(b3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子;

(b4)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-FIP為如下(b5)或(b6):

(b5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子;

(b6)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-BIP為如下(b7)或(b8):

(b7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子;

(b8)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LF為如下(b9)或(b 10):

(b9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子;

(b10)將序列11經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅱ-LB為如下(b11)或(b12):

(b11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子;

(b12)將序列12經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB組成;

所述引物Ⅲ-F3為如下(c1)或(c2):

(c1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子;

(c2)將序列13經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-B3為如下(c3)或(c4):

(c3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子;

(c4)將序列14經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-FIP為如下(c5)或(c6):

(c5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子;

(c6)將序列15經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-BIP為如下(c7)或(c8):

(c7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子;

(c8)將序列16經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LF為如下(c9)或(c10):

(c9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子;

(c10)將序列17經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅲ-LB為如下(c11)或(c12):

(c11)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子;

(c12)將序列18經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB組成;

所述引物Ⅳ-F3為如下(d1)或(d2):

(d1)序列表的序列19所示的單鏈DNA分子;

(d2)將序列19經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-B3為如下(d3)或(d4):

(d3)序列表的序列20所示的單鏈DNA分子;

(d4)將序列20經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-FIP為如下(d5)或(d6):

(d5)序列表的序列21所示的單鏈DNA分子;

(d6)將序列21經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-BIP為如下(d7)或(d8):

(d7)序列表的序列22所示的單鏈DNA分子;

(d8)將序列22經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LF為如下(d9)或(d10):

(d9)序列表的序列23所示的單鏈DNA分子;

(d10)將序列23經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅳ-LB為如下(d11)或(d12):

(d11)序列表的序列24所示的單鏈DNA分子;

(d12)將序列24經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅴ由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB組成;

所述引物Ⅴ-F3為如下(e1)或(e2):

(e1)序列表的序列25所示的單鏈DNA分子;

(e2)將序列25經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列25具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-B3為如下(e3)或(e4):

(e3)序列表的序列26所示的單鏈DNA分子;

(e4)將序列26經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列26具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-FIP為如下(e5)或(e6):

(e5)序列表的序列27所示的單鏈DNA分子;

(e6)將序列27經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列27具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-BIP為如下(e7)或(e8):

(e7)序列表的序列28所示的單鏈DNA分子;

(e8)將序列28經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列28具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LF為如下(e9)或(e10):

(e9)序列表的序列29所示的單鏈DNA分子;

(e10)將序列29經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列29具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅴ-LB為如下(e11)或(e12):

(e11)序列表的序列30所示的單鏈DNA分子;

(e12)將序列30經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列30具有相同功能的DNA分子;

所述引物組Ⅵ由引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB組成;

所述引物Ⅵ-F3為如下(f1)或(f2):

(f1)序列表的序列31所示的單鏈DNA分子;

(f2)將序列31經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列31具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-B3為如下(f3)或(f4):

(f3)序列表的序列32所示的單鏈DNA分子;

(f4)將序列32經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列32具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-FIP為如下(f5)或(f6):

(f5)序列表的序列33所示的單鏈DNA分子;

(f6)將序列33經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列33具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-BIP為如下(f7)或(f8):

(f7)序列表的序列34所示的單鏈DNA分子;

(f8)將序列34經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列34具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LF為如下(f9)或(f10):

(f9)序列表的序列35所示的單鏈DNA分子;

(f10)將序列35經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列35具有相同功能的DNA分子;

所述引物Ⅵ-LB為如下(f11)或(f12):

(f11)序列表的序列36所示的單鏈DNA分子;

(f12)將序列36經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列36具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合的用途為如下(g1)-(g6)中的任意一種:

(g1)鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(g2)制備用于鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的試劑盒;

(g3)鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(g4)制備用于鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的試劑盒;

(g5)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus;

(g6)制備用于檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的試劑盒。

本發明還保護所述引物組合的應用,為如下(g1)-(g6)中的任意一種:

(g1)鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(g2)制備用于鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的試劑盒;

(g3)鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(g4)制備用于鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的試劑盒;

(g5)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus;

(g6)制備用于檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的試劑盒。

本發明還保護含有所述引物組合的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(h1)或(h2)或(h3):

(h1)鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus;

(h2)鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus;

(h3)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus。

本發明還保護所述試劑盒的制備方法,包括將各條引物單獨包裝的步驟。

本發明還保護鑒別煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉和Aspergillus calidoustus的方法,為方法A或方法B。

所述方法A包括如下步驟:以待測曲霉的基因組DNA為模板,分別采用所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組Ⅰ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為煙曲霉;如果采用所述引物組Ⅱ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為土曲霉;如果采用所述引物組Ⅲ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為構巢曲霉;如果采用所述引物組Ⅳ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為黃曲霉;如果采用所述引物組Ⅴ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為黑曲霉;如果采用所述引物組Ⅵ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測曲霉為或候選為Aspergillus calidoustus。

所述方法B包括如下步驟:檢測待測曲霉基因組DNA中是否含有所述引物組Ⅰ至引物組Ⅵ的靶序列,如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅰ的靶序列,待測曲霉為或候選為煙曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅱ的靶序列,待測曲霉為或候選為土曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅲ的靶序列,待測曲霉為或候選為構巢曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅳ的靶序列,待測曲霉為或候選為黃曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅴ的靶序列,待測曲霉為或候選為黑曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅵ的靶序列,待測曲霉為或候選為Aspergillus calidoustus。

本發明還保護鑒定待測微生物是否為煙曲霉或土曲霉或構巢曲霉或黃曲霉或黑曲霉或Aspergillus calidoustus的方法,為方法C或方法D。

所述方法C包括如下步驟:以待測微生物的基因組DNA為模板,分別采用所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組Ⅰ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為煙曲霉;如果采用所述引物組Ⅱ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為土曲霉;如果采用所述引物組Ⅲ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為構巢曲霉;如果采用所述引物組Ⅳ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為黃曲霉;如果采用所述引物組Ⅴ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為黑曲霉;如果采用所述引物組Ⅵ可以實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為或候選為Aspergillus calidoustus,如果采用引物對Ⅰ至引物組Ⅵ均不能實現以所述基因組DNA為模板的特異性擴增,待測微生物為非煙曲霉且非土曲霉且非構巢曲霉且非黃曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus。

所述方法D包括如下步驟:檢測待測微生物基因組DNA中是否含有所述引物組Ⅰ至引物組Ⅵ的靶序列,如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅰ的靶序列,待測微生物為或候選為煙曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅱ的靶序列,待測微生物為或候選為土曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅲ的靶序列,待測微生物為或候選為構巢曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅳ的靶序列,待測微生物為或候選為黃曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅴ的靶序列,待測微生物為或候選為黑曲霉;如果所述基因組DNA中含有所述引物組Ⅵ的靶序列,待測微生物為或候選為Aspergillus calidoustus;如果所述基因組DNA中不含有所述引物組Ⅰ至引物組Ⅵ中任一引物組的靶序列,待測微生物為非煙曲霉且非土曲霉且非構巢曲霉且非黃曲霉且非黑曲霉且非Aspergillus calidoustus。

本發明還保護檢測待測樣本中是否含有煙曲霉和/或土曲霉和/或構巢曲霉和/或黃曲霉和/或黑曲霉和/或Aspergillus calidoustus的方法,為方法E或方法F。

所述方法E包括如下步驟:以待測樣本的總DNA為模板,分別采用所述引物組合中的引物組Ⅰ至引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增,如果采用所述引物組Ⅰ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有煙曲霉;如果采用所述引物組Ⅱ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有土曲霉;如果采用所述引物組Ⅲ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有構巢曲霉;如果采用所述引物組Ⅳ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有黃曲霉;如果采用所述引物組Ⅴ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有黑曲霉;如果采用所述引物組Ⅵ可以實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中含有Aspergillus calidoustus,如果采用引物對Ⅰ至引物組Ⅵ均不能實現以所述總DNA為模板的特異性擴增,待測樣本中不含有煙曲霉且不含有土曲霉且不含有構巢曲霉且不含有黃曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus。

所述方法F包括如下步驟:檢測待測樣本總DNA中是否含有所述引物組Ⅰ至引物組Ⅵ的靶序列,如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅰ的靶序列,待測樣本中含有煙曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅱ的靶序列,待測樣本中含有土曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅲ的靶序列,待測樣本中含有構巢曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅳ的靶序列,待測樣本中含有黃曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅴ的靶序列,待測樣本中含有黑曲霉;如果所述總DNA中含有所述引物組Ⅵ的靶序列,待測樣本中含有Aspergillus calidoustus;如果所述總DNA中不含有所述引物組Ⅰ至引物組Ⅵ中任一引物組的靶序列,待測樣本中不含有煙曲霉且不含有土曲霉且不含有構巢曲霉且不含有黃曲霉且不含有黑曲霉且不含有Aspergillus calidoustus。

以上任一所述方法中,采用所述引物組Ⅰ進行環介導等溫擴增時,反應體系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物組Ⅱ進行環介導等溫擴增時,反應體系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物組Ⅲ進行環介導等溫擴增時,反應體系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物組Ⅳ進行環介導等溫擴增時,反應體系中引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物組Ⅴ進行環介導等溫擴增時,反應體系中引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,采用所述引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增時,反應體系中引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中,環介導等溫擴增反應條件為:65℃恒溫50min。

本發明還保護所述的引物組Ⅰ或引物組Ⅱ或引物組Ⅲ或引物組Ⅳ或引物組Ⅴ或引物組Ⅵ。

本發明還保護所述引物組Ⅰ在制備試劑盒A中的應用,或,所述引物組Ⅱ在制備試劑盒B中的應用,或,所述引物組Ⅲ在制備試劑盒C中的應用,或,所述引物組Ⅳ在制備試劑盒D中的應用,或,所述引物組Ⅴ在制備試劑盒E中的應用,或,所述引物組Ⅵ在制備試劑盒F中的應用;

所述試劑盒A的用途為如下(i1)或(i2):

(i1)鑒定待測微生物是否為煙曲霉;

(i2)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉;

所述試劑盒B的用途為如下(i3)或(i4):

(i3)鑒定待測微生物是否為土曲霉;

(i4)檢測待測樣本中是否含有土曲霉;

所述試劑盒C的用途為如下(i5)或(i6):

(i5)鑒定待測微生物是否為構巢曲霉;

(i6)檢測待測樣本中是否含有構巢曲霉;

所述試劑盒D的用途為如下(i7)或(i8):

(i7)鑒定待測微生物是否為黃曲霉;

(i8)檢測待測樣本中是否含有黃曲霉;

所述試劑盒E的用途為如下(i9)或(i10):

(i9)鑒定待測微生物是否為黑曲霉;

(i10)檢測待測樣本中是否含有黑曲霉;

所述試劑盒F的用途為如下(i11)或(i12):

(i11)鑒定待測微生物是否為Aspergillus calidoustus;

(i12)檢測待測樣本中是否含有Aspergillus calidoustus。

本發明還保護含有所述的引物組Ⅰ的試劑盒A,或,含有所述引物組Ⅱ的試劑盒B,或,含有所述引物組Ⅲ的試劑盒C,或,含有所述引物組Ⅳ的試劑盒D,或,含有所述引物組Ⅴ的試劑盒E,或,含有所述引物組Ⅵ的試劑盒F;

所述試劑盒A的用途為如下(i1)或(i2):

(i1)鑒定待測微生物是否為煙曲霉;

(i2)檢測待測樣本中是否含有煙曲霉;

所述試劑盒B的用途為如下(i3)或(i4):

(i3)鑒定待測微生物是否為土曲霉;

(i4)檢測待測樣本中是否含有土曲霉;

所述試劑盒C的用途為如下(i5)或(i6):

(i5)鑒定待測微生物是否為構巢曲霉;

(i6)檢測待測樣本中是否含有構巢曲霉;

所述試劑盒D的用途為如下(i7)或(i8):

(i7)鑒定待測微生物是否為黃曲霉;

(i8)檢測待測樣本中是否含有黃曲霉;

所述試劑盒E的用途為如下(i9)或(i10):

(i9)鑒定待測微生物是否為黑曲霉;

(i10)檢測待測樣本中是否含有黑曲霉;

所述試劑盒F的用途為如下(i11)或(i12):

(i11)鑒定待測微生物是否為Aspergillus calidoustus;

(i12)檢測待測樣本中是否含有Aspergillus calidoustus。

以上任一所述待測曲霉或待測微生物具體可為煙曲霉、土曲霉、構巢曲霉、黃曲霉、黑曲霉或Aspergillus calidoustus。所述煙曲霉具體可為CGMCC,菌株編號:3.08027的煙曲霉。所述土曲霉具體可為CGMCC,菌株編號:3.08115的土曲霉。所述構巢曲霉具體可為CGMCC,菌株編號:3.06379的構巢曲霉。所述黃曲霉具體可為CGMCC,菌株編號:3.06434的黃曲霉。所述黑曲霉具體可為CGMCC,菌株編號:3.06478的黑曲霉。

以上任一所述待測樣本具體可為人(Homo sapiens)的痰液。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展出的一種敏感、特異、簡便、快捷的核酸擴增技術,其原理是在一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下,識別6-8個區域的4-6條引物,在等溫條件下快速、特異地擴增目的基因,可推廣應用于快速、準確的檢測常見的碳青霉烯類耐藥基因。LAMP方法具有靈敏性高、特異性好、反應時間短、判定結果方便、不需要昂貴儀器等優勢。

本發明提供的引物組合鑒定用于檢測常見的六種曲霉菌,具有高特異性和高靈敏度,可以實現簡便、快速、準確檢測。本發明具有重大的推廣價值。

附圖說明

圖1為實施例2中采用引物組Ⅰ的檢測結果。

圖2為實施例2中采用引物組Ⅱ的檢測結果。

圖3為實施例2中采用引物組Ⅲ的檢測結果。

圖4為實施例2中采用引物組Ⅳ的檢測結果。

圖5為實施例2中采用引物組Ⅴ的檢測結果。

圖6為實施例2中采用引物組Ⅵ的檢測結果。

圖7為實施例4中樣本一的檢測結果。

圖8為實施例4中樣本二的檢測結果。

圖9為實施例4中樣本三的檢測結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明,但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,結果取平均值。

反應液為博奧生物集團有限公司產品,產品目錄號為CP.440020。

DNA拷貝數的計算方法如下:

1A260吸光度值=ds DNA 50μg/ml;

核酸濃度=(OD260)×(稀釋倍數)×(50)=x ng/μl;

平均分子量(MW)代表克/摩爾,單位道爾頓(dolton),即1dolton=1g/mol;

摩爾=6.02×1023;

平均分子量(MW):dsDNA=(堿基數)×(660道爾頓/堿基);

拷貝數計算公式:

(6.02×1023copies/摩爾)×(xng/μl×10-9)/(DNA長度×660)=copies/μl。

實施例1、檢測六種曲霉的引物組合的制備

檢測六種曲霉的引物組合由六個LAMP引物組組成,每個引物組用于檢測一種曲霉。

用于檢測煙曲霉引物組如下(5’→3’):

引物Ⅰ-F3(序列1):GGATGCTGACAACAACGG;

引物Ⅰ-B3(序列2):GGTCGAAGACCTTGAAAGCT;

引物Ⅰ-FIP(序列3):TGTTCTCTCCCCTCCCGAGCACCATCGATTTCCCCGG;

引物Ⅰ-BIP(序列4):ATCAGAATTCCTTACCATGATGGCCCGAATTTCCTCTTCGGAGTC;

引物Ⅰ-LF(序列5):TCATACCGAAAGTATCACATA;

引物Ⅰ-LB(序列6):TCGGAAGATGAAGGACAC。

用于檢測土曲霉引物組如下(5’→3’):

引物Ⅱ-F3(序列7):GATTGCCTCATGCGACC;

引物Ⅱ-B3(序列8):TTGTTGTCAGCATCAACCTC;

引物Ⅱ-FIP(序列9):GGCCTACATGGTGTTAAATGATCGAATCGATTGCATCGTTCTATGTCG;

引物Ⅱ-BIP(序列10):CACCACCAAGGAGCTGGGAGTTGATCATGTCCTGGAGC;

引物Ⅱ-LF(序列11):ACAGAAGATAAAGTCAAGACTC;

引物Ⅱ-LB(序列12):CAGAACCCCTCCGAGT。

用于檢測構巢曲霉引物組如下(5’→3’):

引物Ⅲ-F3(序列13):ACGCGAACTCCCCA;

引物Ⅲ-B3(序列14):GTCATGACGTGACGC;

引物Ⅲ-FIP(序列15):CTGGCCATCATGGTAAGGAACTCATCTACTTCGCACCAGC;

引物Ⅲ-BIP(序列16):AGGACACCGATTCCGAGGAGAGCAGCGGAGATGAAAC;

引物Ⅲ-LF(序列17):TTAGCATTAGTACATTTCT;

引物Ⅲ-LB(序列18):GGCGTTCAAGGTCT。

用于檢測黃曲霉引物組如下(5’→3’):

引物Ⅳ-F3(序列19):ATCTCGGATGTGTCCTGTT;

引物Ⅳ-B3(序列20):GATCGGAGGAGCCATTGT;

引物Ⅳ-FIP(序列21):ACACACCGGAGCCGTCAAGATATCTGCCACATGTTTGCT;

引物Ⅳ-BIP(序列22):AAGTACAGCCTGTATACACCTCGACCTTGCCGTCAGATCCATTC;

引物Ⅳ-LF(序列23):GGTTTGCCTGCAAAGTTG;

引物Ⅳ-LB(序列24):ACGAACGACGACCATATG。

用于檢測黑曲霉引物組如下(5’→3’):

引物Ⅴ-F3(序列25):CCAGATCACCACCAAGGAG;

引物Ⅴ-B3(序列26):CGAGCCATCATGGTAAGGAATT;

引物Ⅴ-FIP(序列27):GTTGATCATGTCCTGAAGCTCAGACCTCGGCACTGTGATGCG;

引物Ⅴ-BIP(序列28):GACGCTGACAACAACGGAACGATCACAATCCAGCCCGCAT;

引物Ⅴ-LF(序列29):GGTTCTGGCCAAGGGAG;

引物Ⅴ-LB(序列30):CGACTTCCCCGGTATGT。

用于檢測Aspergillus calidoustus引物組如下(5’→3’):

引物Ⅵ-F3(序列31):CCCTATTTGTAAGTCG;

引物Ⅵ-B3(序列32):CCTAAACGCATTCACAC;

引物Ⅵ-FIP(序列33):TCACCATCCTTGTCCTGTTCAAAGCACCGATCG;

引物Ⅵ-BIP(序列34):ACTCCGGCAACGTTAAGGCTAATTGATGGGGCTA;

引物Ⅵ-LF(序列35):GAAAAGGGTAAATAA;

引物Ⅵ-LB(序列36):CGCATACGCTCAGC。

用于檢測煙曲霉的引物組命名為引物組Ⅰ。

用于檢測土曲霉的引物組命名為引物組Ⅱ。

用于檢測構巢曲霉的引物組命名為引物組Ⅲ。

用于檢測黃曲霉的引物組命名為引物組Ⅳ。

用于檢測黑曲霉的引物組命名為引物組Ⅴ。

用于檢測Aspergillus calidoustus的引物組命名為引物組Ⅵ。

引物組合中,各單鏈DNA各自獨立包裝。

引物組Ⅰ中,引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩爾比為0.5:0.5:2:2:1:1;

引物組Ⅱ中,引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩爾比為0.5:0.5:2:2:1:1;

引物組Ⅲ中,引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩爾比為0.5:0.5:2:2:1:1。

引物組Ⅳ中,引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩爾比為0.5:0.5:2:2:1:1。

引物組Ⅴ中,引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩爾比為0.5:0.5:2:2:1:1。

引物組Ⅵ中,引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩爾比為0.5:0.5:2:2:1:1。

實施例2、特異性

一、待測樣本的制備

待測樣本1:煙曲霉(CGMCC,菌株編號:3.08027)基因組DNA;

待測樣本2:土曲霉(CGMCC,菌株編號:3.08115)基因組DNA;

待測樣本3:構巢曲霉(CGMCC,菌株編號:3.06379)基因組DNA;

待測樣本4:黃曲霉(CGMCC,菌株編號:3.06434)基因組DNA;

待測樣本5:黑曲霉(CGMCC,菌株編號:3.06478)基因組DNA;

待測樣本6:Aspergillus calidoustus檢測基因質粒DNA;質粒的制備方法如下:在pUC57質粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位點插入Genebank號為HE650910.1的DNA分子,得到重組質粒,該質粒即為Aspergillus calidoustus檢測基因質粒。

二、待測樣本的檢測

以步驟一中的各待測樣本為模板,分別采用實施例1制備的引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ和引物組Ⅵ對模板進行環介導等溫擴增檢測。

反應體系(10μL):7.0μL反應液(博奧生物集團有限公司產品,產品目錄號:CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg),補水至10μL。引物混合物即引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ或引物組Ⅵ中的各條引物組成的混合物。反應體系中,引物F3和引物B3的終濃度均為0.5μM,引物FIP和引物BIP的終濃度均為2μM,引物LF和引物LB的終濃度均為1μM。

反應條件:65℃恒溫50min。

反應過程中,采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

如果在50min內出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量可以被檢測出來。如果在50min內沒有出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量不能被檢測出來。

采用引物組Ⅰ的結果見圖1。結果表明,只有當待測樣本為煙曲霉基因組DNA(待測樣本1)的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線)。當待測樣本為待測樣本2、3、4、5或6的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅱ的結果見圖2。結果表明,只有當待測樣本為土曲霉基因組DNA(待測樣本2)的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線)。當待測樣本為待測樣本1、3、4、5或6的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅲ的結果見圖3。結果表明,只有當待測樣本為構巢曲霉基因組DNA(待測樣本3)的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線)。當待測樣本為待測樣本1、2、4、5或6的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅳ的結果見圖4。結果表明,只有當待測樣本為黃曲霉基因組DNA(待測樣本4)的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線)。當待測樣本為待測樣本1、2、3、5或6的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅴ的結果見圖5。結果表明,只有當待測樣本為黑曲霉基因組DNA(待測樣本5)的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線)。當待測樣本為待測樣本1、2、3、4或6的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅵ的結果見圖6。結果表明,只有當待測樣本為Aspergillus calidoustus檢測基因質粒DNA(待測樣本6)的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線)。當待測樣本為待測樣本1、2、3、4或5的時候均不顯示陽性擴增曲線。

以上結果表明,本發明提供的曲霉引物組合中的六個引物組分別對其靶標基因有很高的特異性。

實施例3、靈敏性

待測樣本1:煙曲霉(CGMCC,菌株編號:3.08027)基因組DNA;

待測樣本2:土曲霉(CGMCC,菌株編號:3.08115)基因組DNA;

待測樣本3:構巢曲霉(CGMCC,菌株編號:3.06379)基因組DNA;

待測樣本4:黃曲霉(CGMCC,菌株編號:3.06434)基因組DNA;

待測樣本5:黑曲霉(CGMCC,菌株編號:3.06478)基因組DNA;

待測樣本6:Aspergillus calidoustus檢測基因質粒DNA;質粒的制備方法如下:在pUC57質粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的SacI位點插入Genebank號為HE650910.1的DNA分子,得到重組質粒,該質粒即為Aspergillus calidoustus檢測基因質粒。

1、將待測樣本用無菌水進行梯度稀釋,得到各個稀釋液。

2、以步驟1得到的稀釋液為模板,分別采用實施例1制備的引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ和引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增。

待測樣本為待測樣本1時,采用引物組Ⅰ進行環介導等溫擴增。待測樣本為待測樣本2時,采用引物組Ⅱ進行環介導等溫擴增。待測樣本為待測樣本3時,采用引物組Ⅲ進行環介導等溫擴增。待測樣本為待測樣本4時,采用引物組Ⅳ進行環介導等溫擴增。待測樣本為待測樣本5時,采用引物組Ⅴ進行環介導等溫擴增。待測樣本為待測樣本6時,采用引物組Ⅵ進行環介導等溫擴增。

反應體系(10μL):7.0μL反應液(博奧生物集團有限公司產品,產品目錄號:CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀釋液(1μL稀釋液中含有的基因組拷貝數分別為103、5×102、102、5×101或101),補水至10μL。引物混合物即引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ或引物組Ⅵ中的各條引物組成的混合物。反應體系中,引物F3和引物B3的終濃度均為0.5μM,引物FIP和引物BIP的終濃度均為2μM,引物LF和引物LB的終濃度均為1μM。

反應條件:65℃恒溫50min。

反應過程中,采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

如果在50min內出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量可以被檢測出來。如果在50min內沒有出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量不能被檢測出來。

結果顯示,引物組Ⅰ檢測靶標基因的靈敏度為5×102個拷貝數/反應體系,引物組Ⅱ檢測靶標基因的靈敏度為5×101個拷貝數/反應體系,引物組Ⅲ檢測靶標基因的靈敏度為5×102個拷貝數/反應體系,引物組Ⅳ檢測靶標基因的靈敏度為5×102個拷貝數/反應體系,引物組Ⅴ檢測靶標基因的靈敏度為5×102個拷貝數/反應體系,引物組Ⅵ檢測靶標基因的靈敏度為5×102個拷貝數/反應體系。

實施例4、臨床樣本檢測

待測樣本為如下樣本一、樣本二或樣本三:

樣本一:已測序鑒定確認含有煙曲霉的人的痰液;

樣本二:已測序鑒定確認含有黃曲霉的人的痰液;

樣本三:已測序鑒定確認含有黑曲霉的人的痰液。

1、提取待測樣本的總DNA。

2、以步驟1提取的總DNA為模板,分別采用實施例1制備的各個引物組對這三個樣本進行環介導等溫擴增,每個引物組合均檢測三種樣本。

反應體系與反應條件均同實施例2。

反應過程中,采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

如果在50min內出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量可以被檢測出來。如果在50min內沒有出現陽性擴增曲線(即擴增曲線為典型的“S型”擴增曲線),表明反應體系中的相應基因組含量不能被檢測出來。

樣本一的結果見圖7。結果表明只有采用引物組Ⅰ檢測的時候顯示陽性擴增曲線。當采用引物組Ⅰ以外的其它幾個引物組的時候均不顯示陽性擴增曲線,與實際情況一致。

樣本二的結果見圖8。結果表明,只有采用引物組Ⅳ檢測的時候顯示陽性擴增曲線。當采用引物組Ⅳ以外的其它幾個引物組的時候均不顯示陽性擴增曲線,與實際情況一致。

樣本三的結果見圖9。結果表明,只有采用引物組Ⅴ檢測的時候顯示陽性擴增曲線。當采用引物組Ⅴ以外的其它幾個引物組的時候均不顯示陽性擴增曲線,與實際情況一致。

以上結果表明,利用本發明提供的曲霉引物組合可以進行6種常見曲霉檢測,結果準確可靠。

<110> 博奧生物集團有限公司

<120> 用于檢測六種曲霉的LAMP引物組合及其應用

<160> 36

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ggatgctgac aacaacgg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggtcgaagac cttgaaagct 20

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tgttctctcc cctcccgagc accatcgatt tccccgg 37

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atcagaattc cttaccatga tggcccgaat ttcctcttcg gagtc 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tcataccgaa agtatcacat a 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

tcggaagatg aaggacac 18

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

gattgcctca tgcgacc 17

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

ttgttgtcag catcaacctc 20

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

ggcctacatg gtgttaaatg atcgaatcga ttgcatcgtt ctatgtcg 48

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

caccaccaag gagctgggag ttgatcatgt cctggagc 38

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

acagaagata aagtcaagac tc 22

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

cagaacccct ccgagt 16

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

acgcgaactc ccca 14

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

gtcatgacgt gacgc 15

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

ctggccatca tggtaaggaa ctcatctact tcgcaccagc 40

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

aggacaccga ttccgaggag agcagcggag atgaaac 37

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

ttagcattag tacatttct 19

<210> 18

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

ggcgttcaag gtct 14

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

atctcggatg tgtcctgtt 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

gatcggagga gccattgt 18

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

acacaccgga gccgtcaaga tatctgccac atgtttgct 39

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

aagtacagcc tgtatacacc tcgaccttgc cgtcagatcc attc 44

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

ggtttgcctg caaagttg 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

acgaacgacg accatatg 18

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

ccagatcacc accaaggag 19

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 26

cgagccatca tggtaaggaa tt 22

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

gttgatcatg tcctgaagct cagacctcgg cactgtgatg cg 42

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 28

gacgctgaca acaacggaac gatcacaatc cagcccgcat 40

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

ggttctggcc aagggag 17

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 30

cgacttcccc ggtatgt 17

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 31

ccctatttgt aagtcg 16

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 32

cctaaacgca ttcacac 17

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

tcaccatcct tgtcctgttc aaagcaccga tcg 33

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 34

actccggcaa cgttaaggct aattgatggg gcta 34

<210> 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 36

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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cgcatacgct cagc 14

再多了解一些
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