高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法與流程

文檔序號:11212352
高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法與流程

本發明屬于蔬菜育種與應用技術領域,涉及一種高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法。



背景技術:

甜瓜是傳統的特色水果和瓜農就業增收的主要經濟作物。甜瓜雜交種的種子純度是種子質量的核心指標,隨著甜瓜產業的發展和生產的需求,越來越多的優質、抗病新品種涌入市場,但由于雜交種子中混入了母本種子導致純度不達標,引起的種子糾紛時有發生,給瓜農造成很大的經濟損失,因此為了保護育種者、種子經營者及瓜農的利益,研究并建立快速、準確有效的種子純度鑒定方法是非常重要的。

在眾多分子標記技術中,SSR技術因其多態性高、操作簡便、結果穩定可靠等優點,在甜瓜、黃瓜、西瓜等瓜類作物的雜交種純度鑒定方面得到了廣泛應用。甜瓜核基因組SSR標記呈現共顯性遺傳方式,電泳檢測時,F1帶型為雙親互補帶型,只能通過單株檢測才能顯示F1種子中混入的母本種子,工作量較大。而在甜瓜雜交種子純度鑒定工作中,母本株通常較少,如果能夠通過混合樣品檢測就可顯示母本的有無,從而迅速判定混合樣品的整體純度,將大幅度減少工作量,顯著提高工作效率,因此,急需尋找能夠進行混合樣品分析的分子標記技術。



技術實現要素:

本發明的目的是提供一種高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法。

本發明提供了一種高通量鑒定甜瓜品種A的雜交種中是否混有其母本自交種的方法,其原理在于:甜瓜的線粒體基因組呈現獨特的父系遺傳特性。電泳檢測時,純合的F1帶型和父本帶型一樣;如果F1帶型是雙親帶型,將表示F1種子中混入了母本種子。該方法具體可包括如下步驟:

(A1)從待測甜瓜種子中隨機選取若干數目的種子,提取基因組DNA,混合后形成混合樣本DNA;

(A2)以步驟(A1)所得混合樣本DNA作為模板,采用根據甜瓜線粒體基因組開發的SSR引物對進行PCR擴增,得到擴增產物;

(A3)將步驟(A2)所得擴增產物進行凝膠電泳,根據電泳譜圖按照如下確定所述待測甜瓜種子是否均為甜瓜品種A的雜交種:若所述電泳圖譜上具有所述甜瓜品種A的父本的特征譜帶且不具有所述甜瓜品種A的母本的特征譜帶,則所述待測甜瓜種子均為所述甜瓜品種A的雜交種,不含其母本自交種;若所述電泳圖譜上同時具有所述甜瓜品種A的父本的特征譜帶和所述甜瓜品種A的母本的特征譜帶,則所述待測甜瓜種子中除了所述甜瓜品種A的雜交種外混有其母本自交種。

所述待測甜瓜種子為所述甜瓜品種A的雜交種,或者所述甜瓜品種A的雜交種與其母本自交種的混合。

在所述方法的步驟(A1)中,所述若干數目可為大于等于2且小于50的整數(如20-40)。

進一步,在本發明的一個實施例中,所述若干數目具體為20,即步驟(A1)中,每20個種子一混合。

在所述方法中,所述凝膠電泳具體為聚丙烯酰胺凝膠電泳;如非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;更加具體如8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

在本發明中,所述8%非變性聚丙烯酰胺溶液具體由20ml ddH2O、4ml 10×TBE、16ml 20%(質量百分比)Acr-Bis、40μl TEMED、400μl 10%(質量百分比)AP配制而成。

在所述方法中,將所述擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,220V穩壓電泳直至溴酚藍指示劑遷移至可以使擴增DNA片段能夠被清楚識別的距離時,停止電泳;銀染法染色,拍照記錄特征譜帶。

在所述方法中,從種子中提取基因組DNA具體為從種子所發幼芽中提取基因組DNA。更加具體的,為:將待測樣品種子35℃發芽3-4天,取1cm左右的幼芽,分別裝入2ml離心管,加入0.1M的NaOH溶液100μl,用組織搗碎儀打碎樣品,沸水水浴1min左右,加入pH 8.0的Tris-HCl緩沖液1ml,充分混勻,得待測樣品基因組DNA,4℃下保存備用。

在所述方法中,進行PCR擴增采用的反應體系如下:基因組DNA 20ng、含Mg2+的10×buffer 1.25μl,dNTP 0.2mmol·L-1 1μl,上下游引物0.25mmol·L-1各1μl,Taq酶5U·μL-10.2μl,ddH2O補足至12.5μl。

在所述方法中,進行PCR擴增采用的退火溫度為55℃。更加具體的,進行PCR擴增采用的擴增程序如下:94℃下預變性5min;94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec,35個循環反應;72℃延伸5min;16℃永久保存。

在本發明的一個實施例中,所述甜瓜品種A為甜瓜品種“糖妃極品”。步驟(A2)中,所述根據甜瓜線粒體基因組開發的SSR引物對為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對。相應的,所述“糖妃極品”的父本的特征譜帶是大小為255bp的目的條帶;所述“糖妃極品”的母本的特征譜帶是大小為243bp的目的條帶。

本發明還請求保護用于鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度的引物對。

所述引物對具體由序列表中序列1和序列2所示兩條單鏈DNA組成。

所述引物對在如下(B1)或(B2)中的應用也屬于本發明的保護范圍:

(B1)鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度;

(B2)制備用于鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度的試劑盒。

其中,所述鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度可為高通量鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度。

本發明的有益效果是:通過合理混合樣品DNA,避免了單株分析,具有簡單、高效等優勢??梢詫⒅辽?0株樣品DNA進行混合,1次PCR檢測即可顯示混合樣品中是否存在母本,大幅度減少了鑒定工作量,將鑒定效率提高20倍左右,具有較高的商業應用價值。

附圖說明

圖1為利用引物mtSSR073擴增“糖妃極品”F1及其父本、母本和不同比例DNA混合樣品的PCR電泳結果?!獗硎灸副?,♂表示父本,F1表示“糖妃極品”,1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50表示混合樣品DNA中的母本與F1體積比。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。

實施例1、用于高通量檢測甜瓜“糖妃極品”雜交種混合樣品純度的方法

一、篩選用于鑒定甜瓜“糖妃極品”純度的mtSSR引物

從Genbank下載甜瓜線粒體基因組序列,使用Mreps 2.5SSR序列鑒定程序,鑒定甜瓜線粒體基因組中含SSR的序列區段,同時設計出跨越SSR位點的PCR引物;

以“糖妃極品”母本、父本、F1為DNA模板進行引物篩選,獲得條帶清晰、差異大、重復性好的引物mtSSR073,其序列為;

mtSSR073F:5’-TGTCGAGTTCACTCTTTCATTAG-3’(序列1);

mtSSR073R:5’-TTCATTCTTTGCTCTCGTTATAC-3’(序列2)。

二、利用特異性引物mtSSR073對甜瓜“糖妃極品”雜交種子混合樣品進行純度鑒定

1、樣品DNA的快速提?。簩⒐┰囂鸸稀疤清鷺O品”以及其父本和母本的種子,35℃發芽3-4天,取0.5-1cm左右的幼芽,分別裝入2ml離心管,加入0.1M的NaOH溶液100μl,用組織搗碎儀打碎樣品,沸水水浴1min左右,加入pH 8.0的Tris-HCl緩沖液1ml,充分混勻,得待測樣品基因組DNA,4℃下保存備用;

2、樣品DNA混合:按照母本與F1(即“糖妃極品”)的體積比為1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的體積比進行樣品DNA混合;

3、PCR擴增

①反應體系

12.5μl反應體系如下:基因組DNA 20ng、含Mg2+的10×buffer 1.25μl,dNTP 0.2mmol·L-1 1μl,上下游引物0.25mmol·L-1各1μl,Taq酶5U·μL-1 0.2μl,ddH2O補足至12.5μl。

②反應條件

94℃下預變性5min;94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec,35個循環;72℃延伸5min;16℃永久保存;

4、聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳

擴增產物在8%聚丙烯酰胺非變性凝膠(由20ml ddH2O、4ml 10×TBE、16ml 20%Acr-Bis、40μl TEMED、400μl 10%AP配制而成。%均表示質量百分比)電泳分離,120V穩壓1.5小時,電泳結束后,0.1%AgNO3銀染6min;然后用2%NaOH、0.4%甲醛顯色,直至條帶清晰即可。

5、拍照記錄樣品DNA的特征譜帶。

6、擴增結果分析:

mtSSR073引物在“糖妃極品”父本、母本均可以擴增出特異標記,母本表現為243bp的特征譜帶,父本表現為相異于母本的255bp特征譜帶,F1表現和父本一樣的255bp特征譜帶。

混合樣品中,當混合比例為1:1、1:5、1:10、1:20時,混合樣品中均顯示出清晰的243bp母本條帶,說明當混樣株數達到20株時,樣品中即使只有1株母本株,也可以被檢測出來。但是,當混合樣品比例降低到1:30甚至1:40時,243bp的母本條帶變弱;混合樣品比例降低到1:50時弱帶消失。說明當混樣株數達到50株時,如果樣品中有1株母本株,將很難被檢測,影響純度鑒定結果的準確性。具體結果如圖1所示。

實施例2、采用混合樣品法高通量檢測“糖妃極品”雜交種樣品純度

一、樣品DNA的快速提取

將待測試的“糖妃極品”F1種子100粒,35℃發芽3-4天,取0.5-1cm左右的幼芽,分別裝入2ml離心管,加入0.1M的NaOH溶液100μl,用組織搗碎儀打碎樣品,沸水水浴1min左右,加入pH 8.0的Tris-HCl緩沖液1ml,充分混勻,得待測樣品基因組DNA,4℃下保存備用;

二、樣品DNA混合

將“糖妃極品”F1種子DNA,按照每20株一混,形成5個混合樣品?;旌系?0株樣品,單株體積相同。

三、PCR擴增

1、反應體系

12.5μl反應體系如下:基因組DNA 20ng、含Mg2+的10×buffer 1.25μl,dNTP 0.2mmol·L-1 1μl,上下游引物0.25mmol·L-1各1μl,Taq酶5U·μL-1 0.2μl,ddH2O補足至12.5μl。

其中,基因組DNA分為兩組:一組為單株DNA;另一組為混樣DNA。即實驗中采用單株檢測和混樣高通量檢測兩種方法平行進行,以驗證高通量檢測方法的準確性。

2、反應條件

94℃下預變性5min;94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec,35個循環;72℃延伸5min;16℃永久保存;

四、聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳

擴增產物在8%聚丙烯酰胺非變性凝膠(由20ml ddH2O、4ml 10×TBE、16ml 20%Acr-Bis、40μl TEMED、400μl 10%AP配制而成。%均表示質量百分比)電泳分離,120V穩壓1.5小時,電泳結束后,0.1%AgNO3銀染6min;然后用2%NaOH、0.4%甲醛顯色,直至條帶清晰即可。拍照記錄樣品DNA的特征譜帶。

五、擴增結果分析

采用單株DNA進行PCR分析時,100株F1單株中有1株表現為母本帶型,說明100株單株中混入了一株母本株;

采用混合樣品DNA進行PCR分析時中,只有混樣1表現為雜合帶型,說明20株F1單株中混入了母本,其余4個混樣均表現為父本帶型,表明這80株均為純合的F1單株。將混樣1進行單株檢測,發現確實有1株母本,與單株檢測結果一致。

<110> 北京市農林科學院

<120> 高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法

<130> GNCLN171418

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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