一種基于熒光PCR檢測ESR1基因突變的引物及探針的制作方法

文檔序號:11246437
一種基于熒光PCR檢測ESR1基因突變的引物及探針的制造方法與工藝

本發明屬于分子生物學技術領域,尤其涉及基于熒光PCR檢測技術,具體涉及一種基于熒光PCR檢測ESR1基因突變的引物及探針。



背景技術:

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發病率占中國女性惡性腫瘤之首。隨著我國經濟的發展和生活方式的改變,發病率也呈現快速上升的趨勢。由于民眾篩查意識的提高及診療水平的提高,乳腺癌患者的總體死亡率呈下降趨勢。然而,對于耐藥復發和有轉移病灶的晚期乳腺癌患者預后仍然很差,也是目前女性腫瘤的主要死亡原因之一。

人類雌激素受體α(Estrogen Receptor Alpha,ESR Α)由ESR1(Estrogen Receptor1)基因編碼。ESRα與其配體雌激素結合后,可激活細胞內一系列的細胞生物學效應。ESR1基因的突變和異常表達均與乳腺癌等疾病的發生有關。

ESR1基因最為常見的突變類型為Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四種突變。這些突變將ESR1轉換為了促癌基因,他們將ER鎖定在一種永久激活的狀態,因此無需激素就可以趨勢腫瘤細胞生長。這就解釋了這些腫瘤會對芳香酶抑制劑產生耐藥的原因。

目前已報道的應用于ESR1檢測的方法主要為:直接測序法及二代測序技術。其中,直接測序技術成本低,準確性高,但是操作復雜,需要PCR后處理等步驟,易污染導致出現假陽性的結果,而且此方法的靈敏度不足,需要基因豐度達到10%時才能精確檢出,故很難在臨床中進行推廣。二代測序技術靈敏度高,但是需要昂貴的儀器及分析設備,導致其檢測成本大大提高,難以作為普適技術。綜上所述,不論是:直接測序法還是二代測序技術在檢測成本和檢測精度上存在不足,需要進一步改進。



技術實現要素:

為了克服傳統檢測技術的缺陷,本發提供了一種基于熒光PCR檢測ESR1基因突變的引物及探針,通過設計等位基因特異性引物,在一個反應中檢測ESR1基因突變。本發明具有特異性強,靈敏度高,操作簡單快速等優點。本發明具體如下:

一種基于熒光PCR檢測ESR1基因突變的引物及探針,包含下列4組下游引物、1組通用上游引物和1組共用阻斷探針,具體為:

(1)針對ESR1基因Y537S突變的下游引物:Y537S1、Y537S2和/或Y537S3,具體為:

Y537S1:5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAG-3’

Y537S2:5’-TCTCCAGCAGCAGGTAAG-3’

Y537S3:5’-CTCCAGCAGCAGGTCTG-3’;

(2)針對ESR1基因Y537C突變的下游引物:Y537C1、Y537C2、Y537C3和/或Y537C4,具體為:

Y537C1:5’-CTCCAGCAGCAGGTCTC-3’

Y537C2:5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAC-3’

Y537C3:5’-CTCCAGCAGCAGGTGAC-3’

Y537C4:5’-TCTCCAGCAGCAGGTTTC-3’;

(3)針對ESR1基因Y537N突變的下游引物:Y537N1、Y537N2、Y537N3和/或Y537N4,具體為:

Y537N1:5’-TCCAGCAGCAGGTCAAT-3’

Y537N2:5’-TCCAGCAGCAGGTCACT-3’

Y537N3:5’-CTCCAGCAGCAGGTCTTT-3’

Y537N4:5’-CCAGCAGCAGGTCGTT-3’

(4)針對ESR1基因Y538G突變的下游引物:Y538G1、Y538G2、Y538G3和/或Y538G4,具體為:

Y538G1:5’-CATCTCCAGCAGCAGCC-3’

Y538G2:5’-CATCTCCAGCAGCACGC-3’

Y538G3:5’-CATCTCCAGCAGCACCC-3’

Y538G4:5’-GCATCTCCAGCAGCAGCC-3’;

(5)針對ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G突變的通用上游引物Fp1、Fp2、Fp3、Fp4和/或Fp5,序列如下:

Fp1:5’-TAGTCCTTTCTGTGTCTTCCCA-3’

Fp2:5’-GGCTCGGGTTGGCTCTAA-3’

Fp3:5’-AGTAACAAAGGCATGGAGCA-3’

Fp4:5’-TTCCCCTTCTAGGGATTTCAGCACT-3’

Fp5:5’-ACTCCTGGGGCTCGGGTTGGC-3’;

(6)針對ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G突變的共用阻斷探針,該阻斷探針的序列及修飾如下:

阻斷探針:5’-FAM-AAGTACGACATGTCTACGA-3’。

進一步說,包括一對內控引物及一條內控引物探針;所述內控引物由TBP Fp和TBP Rp組成,其序列信息如下:

TBP Fp(上游引物):5’-ACTGCGGGCTCTACTTCATC-3’

TBP Rp(下游引物):5’-AGACCGTGGCAGGGAAAC-3’

內控引物探針序列信息如下:

TBP probe:5’-CATTCATGCCAACTAC-HBQ1--3’。

進一步說,針對ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四種突變的下游引物為等位基因特異性引物。

本發明機理:

本發明結合等位特異性PCR技術(ARMS技術)對現有引物及探針進行改進,采用本發明的產品能夠達到操作便捷、成本低的效果,而且本發明的靈敏度也大大提高了檢測,從而可以達到快速準確檢測基因突變的目的。

等位基因特異性PCR(Allele-Specific PCR),也稱為ARMS(Amplification Refractory Mutation System)技術,是一種利用序列特異性引物對模板進行選擇性擴增而達到檢測基因突變的方法。其核心原理是根據PCR過程中DNA聚合酶引導的引物延伸從、引物的3’末端開始,而引物3’末端的堿基與模板的互補配對程度強烈影響聚合酶的識別作用和PCR反應的進行:若這個堿基與模板正?;パa配對(A-T,G-C),則引物可以不間斷延伸,PCR得以高效進行,得到完整的產物;反之,若這個堿基與模板非正常配對,則引物的延伸受到阻滯,PCR效率大大降低。

故將與突變位點對應的堿基放置在引物的3'末端,同時在必要時人為引入其他堿基的錯位配對,便可以達到選擇性擴增某種等位基因的作用。從而達到快速準確檢測基因突變的目的。

本發明技術方案帶來的有益效果

(1)靈敏度高:在本發明中,ESR1突變基因在25ng背景基因下的最低檢出限為0.1%,相較于傳統的技術的1.0%檢出限,大大提高了檢測的靈敏度(提高了一個數量級)。

(2)適用范圍廣:基于設計中pcr反應的特點,本發明可以適用于石蠟包埋組織樣本,血漿樣本等。

(3)特異性強:在本發明中,針對ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四種突變設計的特異性引物具有很高的位點特異性,保證了檢測的準確性,避免了假陽性的產生。

(4)操作簡單,實驗時間短。閉管反應,減少了污染的機率。

綜上所述,本發明在產品價格比現有的測序方法低的同時,檢出限靈敏度比現有產品高出一個數量級,且適用范圍寬。

附圖說明

圖1本發明試劑盒對血液樣本突變檢測結果,樣本中有突變(FAM通道有信號)。

圖2本發明試劑盒對血液樣本內控檢測結果。

圖3是采用本發明的實施例1的試驗結果。

具體實施方式

現通過實施例詳細闡述本發明的技術特點。

實施例1

1.ESR1引物序列:

針對于ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四種突變采用如下8組等位基因特異性引物,作為下游引物,序列如下:

Y537S1:5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAG-3’

Y537S2:5’-TCTCCAGCAGCAGGTAAG-3’

Y537C1:5’-CTCCAGCAGCAGGTCTC-3’

Y537C2:5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAC-3’

Y537N1:5’-TCCAGCAGCAGGTCAAT-3’

Y537N2:5’-TCCAGCAGCAGGTCACT-3’

Y538G1:5’-CATCTCCAGCAGCAGCC-3’

Y538G2:5’-CATCTCCAGCAGCACGC-3’

針對四種突變采用如下2組上游引物,序列如下:

Fp1:5’-TAGTCCTTTCTGTGTCTTCCCA-3’

Fp5:5’-ACTCCTGGGGCTCGGGTTGGC-3’

針對四種突變設計一條共用的阻斷探針,其序列及修飾如下:阻斷探

針:5’-FAM-AAGTACGACATGTCTACGA-3’

同時設計一對內控引物,及一條探針,其序列信息如下:

TBP Fp(上游引物):5’-ACTGCGGGCTCTACTTCATC-3’

TBP Rp(下游引物):5’-AGACCGTGGCAGGGAAAC-3’

TBP probe:5’-CATTCATGCCAACTAC-HBQ1--3’。

將實施例1獲得的發明產物的運用,具體如下:

臨床樣本基因組DNA提?。罕緦嵗菑娜橄侔┗颊叩难獫{中提取DNA,作為PCR檢測的模板。才用的是TIANGEN的血液基因組DNA提取試劑盒。

1)向15ml離心管加入200ul Proteinase K(20mg/ml)溶液。

2)加入0.5-3ml血液樣本,混勻。

3)向裝有血液樣本的離心管中加入2.4ml緩沖液GE,振蕩30sec混勻。

4)65℃放置10min,每隔3min振蕩一次,以助裂解。

5)向樣本中加入2ml的無水乙醇,混勻。

6)將所得溶液和絮狀沉淀的一半轉移至一個吸附柱CB5中,3000rpm離心3min,倒掉廢液,將吸附柱CB5放回收集管中。

7)將步驟6剩余的溶液再轉入同一吸附柱中,重復6的操作。

8)向吸附柱CB5中加入2ml緩沖液GD,5000rpm離心1min,倒掉廢液,將吸附柱CB5放回收集管中。

9)向吸附柱CB5中加入2ml緩沖液PW,5000rpm離心1min,倒掉廢液,將吸附柱CB5放回收集管中。

10)向吸附柱CB5中加入2ml緩沖液PW,5000rpm離心15min,丟棄收集管,將吸附柱CB5放到一個新的15ml離心管中。

11)向吸附膜的中間部位懸空滴加300ul洗脫緩沖液TB,室溫靜置5min,5000rpm離心2min,將溶液收集到離心管中。

紫外分光光度計測定樣本提取量及濃度,稀釋至10ng/ul待用。

儀器:

適用機型ABI7500、宏石96P。

PCR反應體系:

25ul PCR反應體系中包含:Y537S等位基因特異性下游引物200nM-500nM,Y537C等位基因特異性下游引物200nM-450nM,Y537N等位基因特異性下游引物200nM-450Nm,D538G等位基因特異性下游引物200nM-450nM,通用上游引物(Fp)200nM-450nM,阻斷探針100nM-300nM,以及內控上游引物200nM-450nM,內控下游引物200nM-450nM,TBP探針100nM-300nM,2×SYBR green Mix 10-15uL,待測樣本10-50ng,ddH2O補足25uL。

PCR反應程序:

95℃,2~10min,不循環;

95℃,5~16sec,60℃,40~60sec,采集熒光;共計45個循環;

結果判定:

將配置好的各反應體系在熒光實時定量PCR儀器上進行擴增,根據ESR1基因與內控基因的擴增結果(Ct值),即FAM通道和HEX通道的擴增情況來進行結果的判定。對結果的判定有以下三種情況:

(1)樣本在FAM通道和HEX通道均有正常擴增,則該樣本攜帶有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N或Y538G四種突變中的一種或者幾種。

(2)樣本在FAM通道沒有擴增,在HEX通道有正常擴增,則該樣本未攜帶有ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四種突變。

(3)樣本在FAM通道和HEX通道均沒有正常擴增,則表明該樣本中DNA量過差或者加入的DNA量不足,需要重新檢測。圖1為采用本發明產品的試劑盒對血液樣本突變檢測結果,樣本中有突變(FAM通道有信號)。圖2本發明試劑盒對血液樣本內控檢測結果。

下面再以100例復發性乳腺癌樣本作為檢測對象,采用如實施例1的檢測方法,進行試驗:

1)按照上述反應體系參數配置反應溶液,分別加入各乳腺癌DNA樣本50ng進行試驗,結果如圖3所示。

2)根據圖3所示,本發明對100例復發乳腺癌樣本DNA進行檢測,按樣本結果判定可以得出,共有5例樣本攜帶ESR1突變,其余為ESR1野生型。

實施例2

1.ESR1引物序列:

針對于ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及Y538G四種突變采用如下的等位基因特異性引物作為下游引物,序列如下:

Y537S1:5’-TCTCCAGCAGCAGGTTAG-3’

Y537S3:5’-CTCCAGCAGCAGGTCTG-3’

Y537C3:5’-CTCCAGCAGCAGGTGAC-3’

Y537C4:5’-TCTCCAGCAGCAGGTTTC-3’

Y537N3:5’-CTCCAGCAGCAGGTCTTT-3’

Y537N4:5’-CCAGCAGCAGGTCGTT-3’

Y538G3:5’-CATCTCCAGCAGCACCC-3’

Y538G4:5’-GCATCTCCAGCAGCAGCC-3’。

針對四種突變如下的3組公用的上游引物,序列如下:

Fp2:5’-GGCTCGGGTTGGCTCTAA-3’

Fp3:5’-AGTAACAAAGGCATGGAGCA-3’

Fp4:5’-TTCCCCTTCTAGGGATTTCAGCACT-3’。

針對四種突變設計一條共用的阻斷探針,其序列及修飾如下:阻斷探針:5’-FAM-AAGTACGACATGTCTACGA-3’

同時設計一對內控引物,及一條探針,其序列信息如下:

TBP Fp(上游引物):5’-ACTGCGGGCTCTACTTCATC-3’

TBP Rp(下游引物):5’-AGACCGTGGCAGGGAAAC-3’

TBP probe:5’-CATTCATGCCAACTAC-HBQ1--3’。

分別從100例病人的石蠟切片樣本、新鮮組織中提取DNA用于檢測,其他檢測條件同實例1中的實驗條件。結果顯示,石蠟切片樣本、新鮮組織中提取的DNA均可用于檢測,結果與實例1相同,且差異不大。

再多了解一些
當前第1頁1 2 3 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
做爱视频