一種印度毛霉菌還原肉桂醛制備天然3?苯丙醇的方法與流程

文檔序號:11230105

本發明屬于天然香料研究開發領域,特別涉及一種印度毛霉菌還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的方法。



背景技術:

肉桂醛是典型的α,β-不飽和醛,其加氫反應主要有兩條路線:路線1是先加氫生成肉桂醇,再進一步加氫生成3-苯丙醇;路線2是先加氫生成3-苯丙醛,再進一步加氫生成3-苯丙醇。在化學催化肉桂醛的加氫反應中,由于C=O鍵與C=C鍵氫化的競爭反應,導致兩條路線同時進行,得到的產物往往是肉桂醇、3-苯丙醛和3-苯丙醇的混合物(見“Applied Catalysis A:General”2000,(192):247-251,Zhang Y,et al.)。而微生物催化肉桂醛加氫反應的還原產物通常是肉桂醇(見“化工進展”2009,28(8):1431-1434,馬麗等)。若要進一步加氫生成3-苯丙醇,則需再次加入微生物發酵液或濕菌體進行二次反應(見“廣西大學”2013:62,張笮晦)。3-苯丙醇又名氫化肉桂醇、利膽醇,是制備香料、藥物的重要中間體,可用于合成如選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑鹽酸達泊西汀(見“中國藥物化學雜志”2011,21(1):37-39,尹玲麗等)。天然3-苯丙醇產量低,僅存在于草莓、安息香膏、茶葉、桂油等中,在國際市場上供不應求。3-苯丙醇在工業上通常由肉桂酸乙酯催化加氫制得,收率可達85%,其缺點是需用大量乙醚對反應后的濾液進行提取,對環境不友好。

本發明人在科學實驗中偶然發現,以從自然界獲得的一種微生物的濕菌體為還原劑,能將肉桂醛連續還原生成3-苯丙醇。經鑒定:該微生物為印度毛霉菌Mucor indicus,并命名為Mucor indicus XJ33。于是,我們將自己篩選純化的印度毛霉菌Mucor indicus XJ33用于還原肉桂醛的研究,確定了其還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的生產工藝。為微生物法制備肉桂醛衍生物的“天然品”提供參考。



技術實現要素:

本發明要解決的技術問題是提供一種印度毛霉菌還原肉桂醛制備3-苯丙醇的方法,以解決化學合成的3-苯丙醇用于食品、醫藥及化妝品時其安全性收到質疑等問題。本發明首次利用自行篩選的印度毛霉菌濕菌體作為生物還原劑連續還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇,菌株培養簡單,反應條件溫和,環境友好,采用本發明方法制備得到的3-苯丙醇屬于“天然品”范疇,其安全性優于化學合成的3-苯丙醇,具有良好的工業化應用前景。

為了解決以上技術問題,本發明采用以下技術方案:

一種印度毛霉菌還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的方法,其特征在于,包括以下步驟:

S1:將一環斜面培養基上的微生物菌株XJ33接種于已滅菌的發酵培養液中。所述培養液包括以下成分:葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸氫二鉀、氯化鈉、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵。在溫度為30℃,轉速為180r/min下培養72h,制得XJ33發酵液;

S2:將步驟S1制得的XJ33發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體;

S3:將步驟S2制得的XJ33濕菌體分散于緩沖溶液中,加入輔助底物,再加入肉桂醛,在溫度為30℃,轉速為180r/min下轉化72h,制得轉化液;

S4:將步驟S3制得的轉化液抽濾,加入等體積萃取劑進行萃取1~2次,經減壓蒸餾回收萃取劑后,制得含3-苯丙醇的油狀物。

進一步地,步驟S1中所述微生物菌株為印度毛霉菌。

進一步地,步驟S1中所述培養液包括以下成分:葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L。

進一步地,步驟S3中所述的XJ33濕菌體質量濃度為20~100g/L。

進一步地,步驟S3中所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液。

進一步地,所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為6~8。

進一步地,步驟S3中所述肉桂醛的質量濃度為2.096~4.192g/L。

進一步地,步驟S3中所述輔助底物為葡萄糖、乙醇、蔗糖中的一種。

進一步地,所述輔助底物的質量濃度為10~50g/L。

進一步地,步驟S4中所述萃取劑為乙酸乙酯。

本發明具有以下有益效果:

本發明首次利用自行篩選的印度毛霉菌XJ33濕菌體作為生物還原劑連續還原肉桂醛制備3-苯丙醇。菌株培養簡單,反應條件溫和,環境友好,采用本發明方法制備得到的3-苯丙醇屬于“天然品”范疇,其安全性優于化學合成的3-苯丙醇,具有良好的工業化應用前景。

【具體實施方式】

為便于更好地理解本發明,通過以下實施例加以說明,這些實施例屬于本發明的保護范圍,但不限制本發明的保護范圍。

在實施例中,所述印度毛霉菌還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的方法,包括以下步驟:

S1:將一環斜面培養基上的印度毛霉菌XJ33接種于已滅菌的發酵培養液中,所述培養液包括以下成分:葡萄糖30g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L,在溫度為30℃,轉速180r/min下培養72h,制得印度毛霉菌XJ33發酵液;

S2:將步驟S1制得的發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體;

S3:將步驟S2制得的質量濃度為20~100g/L的XJ33濕菌體分散于pH值為6.0~8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入質量濃度為10~50g/L的輔助底物,所述輔助底物為葡萄糖、乙醇、蔗糖中的一種,再加入質量濃度為2.096~4.192g/L的肉桂醛,在溫度為30℃,轉速為180r/min下轉化72h,制得轉化液;

S4:將步驟S3制得的轉化液抽濾,加入等體積乙酸乙酯進行萃取1~2次,經減壓蒸餾回收乙酸乙酯后,制得含3-苯丙醇的油狀物。

下面通過更具體實施例對本發明進行說明。

本發明的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33是一種屬于真菌類印度毛霉菌屬的菌株,該菌株是從土壤中分離,并先后經過肉桂醛耐受性篩選和還原肉桂醛能力的篩選的多輪篩選獲得的,根據16SrDNA分子生物學鑒定,該菌與印度毛霉菌菌(Mucor indicus)的同源性為100%。

實施例1

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將40g/L濕菌體分散到100mLpH6.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入2.096g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例2

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將40g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入2.096g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例3

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將20g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入2.096g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例4

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將80g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入2.096g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例5

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將80g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入30g/L蔗糖作為輔助底物,再加入2.096g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例6

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將80g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入30g/L乙醇作為輔助底物,再加入2.096g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例7

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將80g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入30g/L葡萄糖作為輔助底物,再加入2.096g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例8

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將80g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入10g/L葡萄糖作為輔助底物,再加入2.62g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

實施例9

將一環斜面培養基上的印度毛霉菌(Mucor indicus)XJ33接種到已滅菌的100mL發酵培養液中(葡萄糖30g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏2.5g/L、磷酸氫二鉀1g/L、氯化鈉0.5g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L、七水合硫酸亞鐵0.01g/L),30℃下恒溫培養振蕩器(180r/min)培養72h,得到XJ33發酵液。將發酵液抽濾,得到XJ33濕菌體。將80g/L濕菌體分散到100mLpH8.0的磷酸鹽緩沖溶液中,加入10g/L葡萄糖作為輔助底物,再加入4.192g/L肉桂醛,在30℃,180r·min-1,反應72h,得到轉化液。

分別取實施例1-9的轉化液抽濾,用等體積乙酸乙酯萃取1次,減壓蒸餾至1~2mL后制得含3-苯丙醇的油狀物,所述油狀物用乙酸乙酯定容于10mL容量瓶。取0.6μL用GC進行定量分析,并用GC-MS進行定性分析,分析條件如下:

色譜條件:色譜柱:Rxi-5Sil(30m×0.25mm×0.25μm);進樣口溫度:250℃;程序升溫過程:柱初溫100℃,保留1min,以5℃/min升至200℃,保留1min,再以8℃/min升至250℃;分流比1:30。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源,電離能量70eV,電子倍增器電壓1.5kV,全掃描方式。

定性及定性分析:根據總離子流圖,應用NIST08、NIST08s質譜庫檢索,確認了還原產物為3-苯丙醇。采用外標法,配制一系列不同濃度的3-苯丙醇標準溶液進行GC色譜分析。以各濃度標準溶液的峰面積對其質量濃度(μg/mL)進行線性回歸,得到回歸方程,計算3-苯丙醇的得率,結果見表1。

表1實施例1-9中3-苯丙醇的得率及其性能

由表1可見,采用本發明的方法制備的3-苯丙醇得率較高,從實施例4與實施例5-8制備的3-苯丙醇得率可知,輔助底物(蔗糖、乙醇、葡萄糖)的加入能顯著提高3-苯丙醇的得率。同時所得3-苯丙醇屬于“天然品”范疇,其安全性優于化學合成的3-苯丙醇,具有良好的工業化應用前景。

以上內容不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明,對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干簡單推演或替換,都應當視為屬于本發明由所提交的權利要求書確定的專利保護范圍。

再多了解一些
當前第1頁1 2 3 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
做爱视频