一種高產果膠酶菌株及其應用的制作方法

文檔序號:11230010

本發明屬于微生物技術領域,具體地說,涉及一種高產果膠酶菌株及其應用。



背景技術:

果膠酶是一種能分解果膠的一種復合酶的總稱。果膠酶主要包含原果膠酶(protopectinase)、果膠甲酯酶(Pectin esterase,PE)、果膠裂解酶(Pectinlyase,PL)、聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,PG)、纖維素酶(cellulose)等。原果膠酶(protopectinase)能夠將不溶性的原果膠水解成為水溶性的果膠,從而切斷阿拉伯糖和聚甲氧基半乳糖醛酸之間的化學鍵;果膠裂解酶(PL)可使長鏈分子的果膠鏈斷裂,形成眾多短鏈分子的果膠;果膠甲酯酶(PE)和聚半乳糖醛酸酯酶(PG)的主要功能作用是將短鏈果膠水解成更小的分子,使其凝聚并沉降分離;纖維素酶可降低粘度,增加內源酶的擴散,提高酶與其它成分的接觸面積,促進果膠等大分子物質的分解。

由于葡萄中含有大量果膠會導致澄清困難、出汁率低、過濾效率差等問題。且在葡萄浸漬過程中,這些存在于葡萄皮和果肉中的大量果膠也會阻礙色素和單寧的浸提、溶解和穩定,從而增加葡萄酒釀造的難度。因此,在適當工藝階段添加果膠酶后,果膠將被較為徹底地分解,使得葡萄汁澄清和過濾更為容易,同時大大提高出汁率,從而提高自流酒產量。目前有關果膠酶的研究主要集中于產酶菌種的篩選、酶的提取分離以及提高果汁出汁率和澄清方面。

遺憾的是,目前我國葡萄酒工業中所用的果膠酶幾乎被德國、法國、意大利、丹麥、荷蘭、日本和西班牙等國的酶制劑公司壟斷。顯然,與國外相比,我國在該領域的工作無論是理論深度,還是應用開發都存在不小的差距。隨著我國葡萄酒和其它果酒果汁業的迅猛發展,國內對果膠酶的需求量也呈上升趨勢。因此,盡快推出擁有自主知識產權、低成本、活力高,穩定性好,專一性強的果膠酶制劑是我國葡萄酒行業亟需解決的問題。



技術實現要素:

本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷,提供一種高產果膠酶菌株及其應用,實現了從葡萄園土壤中篩選得到了高產果膠酶且酶活高的菌株,保證了果膠酶的有效生產,也做到了產量的提高。

其具體技術方案為:

一種高產果膠酶菌株,所述菌株命名為塔賓曲霉Rn14-88A(Aspergillus tubingensis Rn14-88A),該菌株,已于2016年11月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No.13184。

進一步,所述菌株的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:1所示。

本發明所述高產果膠酶菌株在果膠酶制劑制備過程中的應用。

與現有技術相比,本發明的有益效果為:

本發明的塔賓曲霉Rn14-88A可以高產果膠酶,該果膠酶酶活的最適pH在3-4左右,非常適合葡萄酒的環境。這種果膠酶具有可以應用于葡萄酒發酵生產中的潛力。

本發明的塔賓曲霉Rn14-88A可采用液態發酵生產果膠酶,該生產過程涉及到種子的培養、液體發酵及相關的后處理工作。所采用的液體發酵培養基原料來源成本低,操作工藝簡單。因此,該高產果膠酶菌株具有生產成本低,產品酶活高的特點。

本發明的塔賓曲霉Rn14-88A是從葡萄園土壤中篩選得到,塔賓曲霉為國家衛生部和FDA公布的食品安全菌株,不存在任何安全性隱患。因此,本發明的塔賓曲霉用于制備葡萄酒用果膠酶安全可靠。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。

下例實施中,如無特殊說明,無菌均為高溫殺菌(121℃,20min)。

下列實施中富集培養基配方如下:

果膠2g·L-1、硫酸銨3g·L-1、磷酸二氫鉀1.4g·L-1、十二水合磷酸氫二鈉4.2g·L-1、七水合硫酸亞鐵0.01g·L-1、七水合硫酸鎂0.5g·L-1、瓊脂20g·L-1。

下列實施中的基礎培養基配方如下:

桔皮粉20g·L-1、蛋白胨5g·L-1、七水合硫酸鎂1g·L-1、氯化鈉1g·L-1、三水合磷酸氫二鉀1g·L-1、磷酸二氫鉀0.5g·L-1。

下列實施中固體培養基配方如下:

桔皮粉20g·L-1、蛋白胨5g·L-1、七水合硫酸鎂1g·L-1、氯化鈉1g·L-1、三水合磷酸氫二鉀1g·L-1、磷酸二氫鉀0.5g·L-1、瓊脂20g·L-1。

一、高產果膠酶菌株塔賓曲霉Rn14-88A的獲得

1、菌株的初篩

將從葡萄園中取回的土壤稱取10g于100mL的三角瓶中,加入90mL無菌生理鹽水,通過磁力攪拌器攪拌30-40min,攪拌均勻后靜置澄清,吸取20μL的澄清液均勻涂布于富集培養基平板上,每個樣分別做10個平行,在27-30℃的培養箱中培養5-7天。將平板上長出的各種霉菌分別用無菌牙簽挑取單菌落于新的富集培養基平板上,在27-30℃的培養箱中培養3-7天。重復單菌落純化的操作,直至每個平板上長出的菌落為純種單菌落為止。將生長出來的單菌落轉接到斜面培養基上生長10天左右。將轉接前的單菌落平板用3-5mL盧戈氏碘液(2g碘化鉀,1g碘,用蒸餾水定容至300mL)染色10-30min,觀測單菌落的透明圈直徑Dp與菌落直徑Dc。挑選出Dp/Dc比值較大的菌株為初篩菌株。將所得所有菌株保存于甘油凍存管中(裝有濃度為20%的無菌甘油),置于-40℃冰箱中保存。

2、菌株的復篩

將初篩得到的菌株分別接種于基礎發酵培養基中,30℃,160rpm振蕩活化培養2天。將活化后的菌株分別轉接到250mL的三角瓶中的基礎培養基中,30℃,160rpm振蕩培養2天。將擴大培養的菌株發酵液分別于9000rpm,4℃,15min離心,取上清液作為粗酶液,取1mL用作檢測。通過檢測各個菌株的果膠酶活力,最終獲得酶活較高的塔賓曲霉Rn14-88A,酶活為8363.215U/mL。塔賓曲霉Rn14-88A,已于2016年11月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No.13184。

3、果膠酶酶活力測定方法

采用酶標儀測定。果膠酶酶活的定義:單位時間內每1mL粗酶液水解底物生成1mg半乳糖醛酸的能力,定義為一個酶活單位(U)。果膠酶酶活測定條件為:將發酵液于9000rpm,4℃,離心15min,上清液即為粗酶液,取1mL用作檢測。果膠酶檢測反應體系:含1%果膠(底物)的檸檬酸緩沖液(pH5.0)2mL。果膠酶檢測的反應條件為:將反應體系置于50℃的水浴鍋中恒溫水浴6min,水浴加熱后分別加入稀釋兩倍的待測樣品200μL(滅活的酶液為空白對照),充分反應30-40min,再加入3mLDNS(3.25g 3,5-二硝基水楊酸,2moL·L-1氫氧化鈉162.5mL,22.5g丙三醇,用蒸餾水定容至500mL)試劑,于水浴鍋中沸水浴10min后加蒸餾水定容,在562nm處測定吸光值。

4、霉菌菌株的鑒定

該菌株在富集培養基上培養5天后,菌落直徑達6-8mm,菌落初期為白色,后逐漸變為淺黃色,最后變為黃褐色,邊緣圓形、整齊;菌落正面有大量孢子,暗黃色,無滲出液;菌落的背面略顯淺黃色。

塔賓曲霉Rn14-88A的ITS鑒定結果如下:

內轉錄間隔區1和2序列(578bp):

ACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTATACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTTTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT。

與相關模式菌株塔賓曲霉F43-02相似性:100%,鑒定為塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)。

二、塔賓曲霉Rn14-88A的產酶特性

按上述步驟3“果膠酶酶活力測定方法”進行發酵產物的酶活測定,該塔賓曲霉Rn14-88A可同時產多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠裂解酶(PL)、果膠甲酯酶(PE)、纖維素酶,且酶活力均較高。

由于果膠酶為復合酶,因此,本發明所測試的酶反應最適反應條件為復合酶的最適反應條件。經檢測,其適宜反應溫度范圍為45-55℃,最適反應溫度為50℃。適宜的pH作用范圍是2.8-5.5,最適反應的pH為3左右。綜上所述,塔賓曲霉Rn14-88A所產果膠酶的最適反應溫度為50℃和pH為3.0,適合葡萄酒生產使用。

三、塔賓曲霉Rn14-88A在制備葡萄酒用果膠酶的應用

1、液態發酵塔賓曲霉Rn14-88A制備葡萄酒用果膠酶

將塔賓曲霉Rn14-88A以桔皮粉為主要原料發酵生產果膠酶,其主要發酵方法是:

(1)種子液的獲得,將原始保存于甘油凍存管中的霉菌菌株200μL接種于裝有6mL無菌基礎發酵培養基中30℃,160rpm振蕩活化培養40小時獲得種子液。

(2)液態發酵

將上述所獲得的種子轉接到250mL裝有50mL無菌基礎發酵培養基三角瓶中,30℃,160rpm振蕩活化培養2天得擴大培養產物。

(3)液態發酵產物的獲得

將上述所得擴大培養產物轉入50mL離心管中,9000rpm,4℃,離心15min,上清液即為粗酶液。

(4)產品處理

將濃度為50%的無菌瓊脂(50g瓊脂,加蒸餾水定容至100mL)溶液冷卻至不凝固的適當溫度,按4%的比例緩慢加入步驟(3)所獲得酶液并迅速混勻,待完全冷卻凝固后即得到固體發酵產物。將上述獲得的固體發酵產物在65℃的烘干箱中烘干,粉碎,得到發酵產物葡萄酒用果膠酶。

以上所述,僅為本發明較佳的具體實施方式,本發明的保護范圍不限于此,任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內,可顯而易見地得到技術方案的簡單變化或等效替換均屬于本發明的保護范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 西北農林科技大學

<120> 一種高產果膠酶菌株及其應用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 578

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acctgcggaa ggatcattac cgagtgcggg tcctttgggc ccaacctccc atccgtgtct 60

attataccct gttgcttcgg cgggcccgcc gcttgtcggc cgccgggggg gcgcctttgc 120

cccccgggcc cgtgcccgcc ggagacccca acacgaacac tgtctgaaag cgtgcagtct 180

gagttgattg aatgcaatca gttaaaactt tcaacaatgg atctcttggt tccggcatcg 240

atgaagaacg cagcgaaatg cgataactaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga 300

gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360

tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gtcgccgtcc ccctctccgg ggggacgggc 420

ccgaaaggca gcggcggcac cgcgtccgat cctcgagcgt atggggcttt gtcacatgct 480

ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tttttccagg ttgacctcgg 540

atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaat 578

再多了解一些
當前第1頁1 2 3 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
做爱视频