真菌毒素復合免疫吸附劑和免疫親和柱與試劑盒及其應用的制作方法

文檔序號:3585362
專利名稱:真菌毒素復合免疫吸附劑和免疫親和柱與試劑盒及其應用的制作方法
技術領域
本發明涉及一種免疫吸附劑,以及裝有該免疫吸附劑的免疫親和柱和試劑盒及其它們在純化黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中的應用。
背景技術
黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等產生的一組結構類似的次生代謝產物,是一組以二吠喃香豆素為基本結構的化合物。目前已分離鑒定出12種,尤其是黃曲霉毒素B1,B2,GijG2^M1和M2為強污染物質,廣泛存在于糧食谷物和飼料及其加工品中,在目前已知的兩百多種真菌毒素中毒性最強、污染頻率最高。黃曲霉毒素具有誘導突變、抑制免疫和致癌的作用。黃曲霉毒素作用的靶器官主要是肝臟,被公認為致肝癌物質,即使食用含有低水平的黃曲霉毒素食物,長期食用的人其肝臟也將受到損害。國際癌癥中心將其定為一類致癌劑。玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素,它首先從有赤霉病的玉米中分離得到。玉米赤霉烯酮的產毒菌主要是鐮刀菌屬的菌株,如禾谷鐮刀菌和三線鐮刀菌。玉米赤霉烯酮及其同類物主要污染玉米、小麥、 大米、大麥、小米和燕麥等谷物,其中,玉米的陽性檢出率為45%,最高含毒量可達到2909mg/kg ;小麥的檢出率為20%,含毒量為0.364-11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮及其同類物的耐熱性較強,110°C下處理Ih才被完全破壞。玉米赤霉烯酮及其同類物具有雌激素作用,主要作用于生殖系統,可使家畜、家禽和實驗小鼠產生雌性激素亢進癥。妊娠期的動物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮及其同類物的食物可引起流產、死胎和畸胎。食用含赤霉病麥面粉制作的各種面食也可引起中樞神經系統的中毒癥狀,如惡心、發冷、頭痛、神智抑郁和共濟失調等。雜色曲霉素是由雜色曲霉、構巢曲霉等產生的一種具有致癌性的真菌毒素,在化學結構上屬于黃曲霉毒素前體物質,可與DNA形成加合物。雜色曲霉素產生菌及雜色曲霉素在世界各地糧食及飼料中的污染很常見。國內學者研究發現,我國各地糧食中雜色曲霉素的污染非常普遍,其中以小麥最明顯,污染率最高可達100%。雜色曲霉素可能與胃癌、肝痛的發生密切相關。赭曲霉毒素是由赭曲霉和純綠青霉產生的一種霉菌腎毒素,可分為A和B兩種類型,赭曲霉毒素A的毒性較大。赭曲霉毒素在4°C的低溫下赭曲霉即可產生具有毒害作用濃度的赭曲霉毒素。動物攝入Ippm體重劑量的赭曲霉毒素A可在5-6天致死。常見的病變是腎小管上皮損傷和腸道淋巴腺體壞死。飼喂含Ippm濃度赭曲霉毒素的日糧3個月可引起動物煩渴、尿頻、生長遲緩和飼料利用率降低;飼喂含量低至200ppb的日糧數周可檢測到腎損傷。其他的臨床癥狀還有腹瀉、厭食和脫水。有時臨床癥狀不明顯,而在赭曲霉毒素中毒呈地方流行病的地區,動物在屠宰時惟一可觀察到的病變是腎蒼白、堅硬。目前,黃曲霉毒素、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物和赭曲霉毒素A的檢測方法主要有薄層層析法,酶聯免疫法(ELISA),免疫親和層析-液相色譜法,免疫親和層析-熒光光度法等。其中,薄層層析法要接觸大量的標準品,不利于實驗者的健康,而且靈敏度很低。酶聯免疫法,只適用于定性檢測,很容易出現假陽性和假陰性的現象。而免疫親和層析-液相色譜法可以定量地檢測許多商品中的黃曲霉毒素的含量。由于該方法靈敏特異,而且不使用有毒的溶劑如氯仿和二氯甲烷等,應用越來越廣泛。免疫親和層析方法的關鍵在于選擇一種高效特異的抗體,但是,利用現有技術中的液液提取、固相萃取、加熱蒸發濃縮等方法的添加回收率均較低,對后續的檢測步驟造成很強的基質效應,并且現有技術中沒有能夠同時純化待處理基質中6種黃曲霉毒素(BpB2、G1' G2, M1 和 M2)、6 種玉米赤霉烯酮同類物(a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN 和 ΖΟΝ)、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的免疫吸附介質,而能夠同時純化分析多種病毒素顯然能夠提高檢測的效率。因此,當務之急,是要制備出性能穩定、特異的免疫吸附劑,并建立一種經濟、快捷、精確、安全,并且能同時純化6種黃曲霉毒素、6種玉米赤霉烯酮、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種免疫吸附劑,以及裝有該免疫吸附劑的免疫親和柱(IAC)和試劑盒,及其它們在純化以及檢測玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β-ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中的應用,和在純化和檢測黃曲霉毒素B1' B2、G1' G2、M1'M2、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、ΖΟΝ、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A中的應用,以及具體提供一種純化黃曲霉毒素G2、MpM2、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、ΖΟΝ、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法,和一種檢測黃曲霉毒素G2為為、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、ΖΟΝ、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的方法。本發明的第一方面是提供一種免疫吸附劑,其特征在于,該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯的抗體,所述抗體包括由雜交瘤細胞株CGMCC N0.5504(已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC))分泌得到的單克隆抗體和由雜交瘤細胞株CGMCC N0.5505(已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)分泌得到的單克隆抗體。本發明的第二方面是提供裝載有上述免疫吸附劑的免疫親和柱。本發明的第三方面是提供含有上述免疫吸附劑或上述免疫親和柱的試劑盒,優選地,所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液,所述洗脫液優選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種,所述保存液優選為含有0.001-0.1重量%的NaN3的PBS緩沖液。本發明的第四方面是提供上述免疫吸附劑、上述免疫親和柱、或上述試劑盒在純化以及檢測玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a -ZOL, β-ZER、β-Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中至少一種中的應用。本發明的第五方面是提供上述免疫吸附劑、上述免疫親和柱、或上述試劑盒在純化以及檢測黃曲霉毒素K、B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER, β-Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中至少一種中的應用。本發明的第六方面是提供一種純化黃曲霉毒素G2JpM2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N和赭曲霉毒素A的方法,該方法包括,使含有黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的液體樣品通過上述免疫親和柱,使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素氏、B2、Gp G2、Mp M2、至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ΖΑΝ、ΖΟΝ、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至該免疫親和柱上,然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素G2、MpM2、至少部分玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a -ZOL, β-ZER、β _Z0L、ZAN、ΖΟΝ、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來。本發明的第七方面是提供一種檢測黃曲霉毒素G2JpM2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N和赭曲霉毒素A的方法,該方法包括,(I)根據上述純化黃曲霉毒素GyMpM2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的方法,得到待測液,所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素B2、G1, G2、M1, M2、至少部分玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β-ZER、β _Z0L、ZAN、ΖΟΝ、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來而得到的溶液;(2)使所述待測液進入檢測系統,并通過與標準品比較進行定性或定量檢測。本發明通過開發出性能穩定、特異的單克隆抗體,實現了對6種黃曲霉毒素、雜色曲霉素、6種玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的同時純化和檢測。由實施例的結果可以看出,對花生樣品和牛奶樣品的檢測中,添加回收率都在80-100%之間,RSD均小于5%。表明本發明的方法完全 兩足對黃曲霉毒素B1' B2> G1^ G2> M1^ M2、雜色曲霉素、玉米赤霉稀麗冋類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A純化和檢測的分析要求。


附圖是用來提供對本發明的進一步理解,并且構成說明書的一部分,與下面的具體實施方式
一起用于解釋本發明,但并不構成對本發明的限制。在附圖中:圖1為黃曲霉毒素B1'B2、G1'G2、M1和M2標準品的液相色譜圖;圖2為雜色曲霉素標準品的液相色譜圖;圖3為玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON標準品的液相色譜圖;圖4為赭曲霉毒素A標準品的液相色譜圖。
具體實施例方式本發明提供一種免疫吸附劑,其特征在于,該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯的抗體,所述抗體包括由雜交瘤細胞株CGMCCN0.5504 (抗體Α)分泌得到的單克隆抗體和由雜交瘤細胞株CGMCCN0.5505 (抗體B)分泌得到的單克隆抗體。優選地,所述抗體還包括由雜交瘤細胞株CGMCC N0.5506分泌得到的單克隆抗體(抗體C)。

雜交瘤細胞株ZEN-F09BIOCGMCC N0.5504已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,北京市朝陽區北辰西路I號院3號,分類命名為抗玉米赤霉醇單克隆抗體細胞株;雜交瘤細胞株0TA-E11B8 CGMCC N0.5505已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,北京市朝陽區北辰西路I號院3號,分類命名為抗赭曲霉毒素A單克隆抗體細胞株;雜交瘤細胞株Afla-D12A1CGMCCN0.5506已于2011年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,北京市朝陽區北辰西路I號院3號,分類命名為抗雜色曲霉素黃曲霉毒素單克隆抗體細胞株。其中,本發明中,所述抗體A為抗玉米赤霉烯酮同類物a-ZER(a-玉米赤霉醇,a-zearalanol)、a-ZOL( α -玉米赤霉烯醇,a-zearalenol)、β-ΖΕΙ (β-玉米赤霉醇,β-zearalanol)、β-ZOL ( β -玉米赤霉烯醇,β-zearalenol)、ZAN(玉米赤霉酮,zearalanone)和Ζ0Ν(玉米赤霉烯酮,zearalenone)中至少一種的單克隆抗體。本發明中雜交瘤細胞株CGMCC N0.5504和抗體A的制備方法可以為本領域常規的制備方法。即,首先將玉米赤霉烯酮同類物半抗原與載體蛋白偶聯,制備作為免疫原,然后將該免疫原對小鼠進行免疫,通過將脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合和雜交瘤細胞克隆化篩選得到所需的雜交瘤細胞株以及由其分泌的單克隆抗體。其中,所述載體蛋白可以為牛血清蛋白或卵清蛋白。具體地,該方法可以包括以下步驟:(I)制備玉米赤霉烯酮免疫原將5mg玉米赤霉烯酮ZON溶于4mL卩比唳中,加入3mg的O-羧甲基輕胺,在室溫下攪拌24h,之后真空干燥,用水溶解后調pH到8.0,用乙酸乙酯提取3次,脫水結晶。將結晶物溶于二氧六環中配成5mmol/L的溶液,稱取30mg BSA溶于2mL、0.05mol/L (pH 7.4)的PBS中。4°C下,將二者混合,再向其中緩慢滴加3mg的N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)和溶于0.5mL二氧六環的溶液中的6mg的N,N’ - 二環己碳二亞胺(DCC),將所得混合物于室溫下攪拌反應24h,透析、離心、冷凍備用。

(2)制備雜交瘤細胞和抗玉米赤霉烯酮的單克隆抗體動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠。用玉米赤霉烯酮免疫原免疫5只小鼠。取適量玉米赤霉烯酮免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐劑,制成乳化劑進行免疫,之后佐劑改為不完全佐劑,共免疫6次,每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外,其余均為腹腔注射。免疫結束后處死小鼠,取脾細胞。細胞融合:將脾細胞和雜交瘤細胞按照10: I的比例進行細胞融合試驗。雜交瘤細胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,直到得到對玉米赤霉烯酮有很好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌玉米赤霉烯酮抗體的雜交瘤細胞CGMCCN0.5504,制備出單克隆抗體。本發明所述抗體B為抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體。本發明中雜交瘤細胞株CGMCC N0.5505和抗體B的制備方法可以為本領域常規的制備方法。即,首先將赭曲霉毒素A半抗原與載體蛋白偶聯,制備作為免疫原,然后將該免疫原對小鼠進行免疫,通過將脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合和雜交瘤細胞克隆化篩選得到所需的雜交瘤細胞株以及由其分泌的單克隆抗體。其中,所述載體蛋白可以為牛血清蛋白或卵清蛋白。具體地,該方法可以包括以下步驟:
(I)制備赭曲霉毒素A免疫原將2mg赭曲霉毒素A (OTA)加入到500 μ L丙酮中,加入4mg CDI,得到第一溶液。將8mg BSA加入到3mL 0.1M pH9.6的碳酸鹽緩沖液中,得到BSA溶液。把第一溶液慢慢滴加到BSA溶液中,室溫反應2天,反應后溶液在4°C條件下,用PBS溶液透析3天。(2)制備雜交瘤細胞和抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠。用赭曲霉毒素A免疫原免疫5只小鼠。取適量赭曲霉毒素A免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐劑,制成乳化劑進行免疫,之后佐劑改為不完全佐劑,共免疫6次,每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外,其余均為腹腔注射。免疫結束后處死小鼠,取脾細胞。細胞融合:將脾細胞和雜交瘤細胞按照10: I的比例進行細胞融合試驗。雜交瘤細胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,直到得到對赭曲霉毒素A有很好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌赭曲霉毒素A抗體的雜交瘤細胞CGMCCN0.5505,制備出單克隆抗體??贵wC為抗黃曲霉毒素B2、Gp G2、Mp M2,和雜色曲霉素中至少一種的單克隆抗體。本發明中的雜交瘤細胞株CGMCC N0.5506和抗體C的制備方法可以為本領域常規的制備方法。即,首先將黃曲霉毒素半抗原與載體蛋白偶聯,制備作為免疫原,然后將該免疫原對小鼠進行免疫,通過將脾細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合和雜交瘤細胞克隆化篩選得到所需的雜交瘤細胞株以及由其分泌的單克隆抗體。其中,所述載體蛋白可以為牛血清蛋白或卵清蛋白。具體地,該方法可以包括以下步驟:(I)制備黃曲霉毒素免疫原將4mg黃曲霉毒素B1溶于2mL丙酮中,加入40yL 10%的H2SO4,在56°C攪拌反應4h,將反應所得產物蒸干后,加入5mLH20,用25mL氯仿提取兩次,然后用20mL H2O洗滌有機層,保留有機層,蒸去有機溶劑,得到黃色固體產物。取1.0mg黃色固體產物,向其中加入2mL 0.5%的BSA溶液(4mL PBS中溶解20mgBSA),在 37°C 下反應 30min ;加入 100 μ L6.5mM 的 NaHB4,在 4°C 反應 30min ;加入 50 μ L 0.1N的HC1,除去過量的NaHB4。在4°C條件下,用PBS溶液透析3天,制得免疫原,即黃曲霉毒素B1-BSA(Aflatoxin B1-BSA)。(2)制備雜交瘤細胞和抗黃曲霉毒素和雜色曲霉毒素的單克隆抗體動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠。用黃曲霉毒素B1-BSA免疫5只小鼠。取適量黃曲霉毒素B1-BSAaooyg/只)加等量弗氏完全佐劑,制成乳化劑進行免疫,之后佐劑改為不完全佐劑,共免疫6次,每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外,其余均為腹腔注射。免疫結束后處死小鼠,取脾細胞。細胞融合:將脾細胞和雜交瘤細胞按照10: I的比例進行細胞融合試驗。雜交瘤細胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,直到得到對黃曲霉毒素和雜色曲霉毒素都有很好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌黃曲霉毒素和雜色曲霉毒素抗體的雜交瘤細胞CGMCC N0.5506,制備出單克隆抗體。本發明中,上述的各種免疫原與載體蛋白的相對用量均可以為本領域常規選擇,例如,各種免疫原與載體蛋白的摩爾比均為2-8: I。所述固相載體可以為本領域常規的各種適用于與抗體進行偶聯的固相載體,包括但不限于纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠中的至少一種,優選為溴化氰(CNBr)活化的瓊脂糖凝膠;所述瓊脂糖凝膠的濃度可以為常規的各種選擇,如4%。該CNBr活化的瓊脂糖凝膠可以以干粉形式商購獲得,如購自美國GE公司,使用時,加入酸溶液進行溶脹即可,該酸處理方法已為本領域技術人員公知,在此不再贅述。當使用凍干形式并含有添加劑的CNBr活化的瓊脂糖凝膠時,優選在低PH值(如pH值為2-3)的條件下洗去添加劑,然后再與抗體進行偶聯。所述將抗體A、抗體B和抗體C與固相載體偶聯的方法可以為本領域常規的方法,具體地,該方法可包括:(I)用偶聯緩沖液溶解抗體,所述抗體為抗體A、抗體B和抗體C,得到第一抗體溶液,(2)使所述第一抗體溶液與活化的固相載體接觸進行偶聯,得到偶聯液,(3)將偶聯液中偶聯后 的固相載體轉移至濃度為0.05-1M的Tris-HCl緩沖液中靜置,以封閉偶聯液中偶聯后的固相載體上的殘留活性位點,(4)用洗滌液洗滌靜置后的固相載體,以去除未偶聯的抗體,得到洗滌后的固相載體,(5)用含有0.001-0.1重量%的NaN3的PBS緩沖液清洗洗滌后的固相載體。本發明對所述抗體和固相載體的用量比例以及抗體A、抗體B和抗體C的相對用量沒有特別的限定,一般地,使所述抗體與固相載體盡可能飽和偶聯,因此,所述抗體一般過量于固相載體。但是,本領域技術人員也可以根據需要選擇抗體與固相載體的用量比。本發明中,所述抗體A、抗體B和抗體C與固相載體的重量比優選為1: 0.2-5: 0.2-5: 5_10。本發明中所述偶聯緩沖液可以為本領域常規的各種選擇,如0.1-0.3M的NaHCO3溶液,PH值可以為8-8.5。偶聯條件和偶聯方法可以為常規的選擇,如,可以在4_25°C條件下,采用翻轉式(end-over-end)的方法將抗體與固相載體充分均勻混合1_24小時。所述封閉和除去未偶聯的抗體的方法也可以為本領域的常規方法。其中,所述在0.05-1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中靜置的條件可以為,在4_25°C下,靜置2_4小時。所述用洗滌液洗滌靜置后的固相載體中的洗滌液可以為低、高兩種PH值的緩沖液(如pH4.0的醋酸鹽緩沖液和PH8.0的Tris-HCl緩沖液),所述洗滌的條件只要使得未偶聯的抗體基本被除去即可,一般地,按照依次用低、高PH的緩沖液洗滌的順序至少洗滌3個循環??梢酝ㄟ^測量未偶聯的抗體的量來計算兩種抗體總的偶聯率,偶聯率計算公式為:
,n/、—偶聯前抗體總量(A+B+C)-未偶聯的抗體量(A+B+C) ο偶聯前抗體總量(A+B+C)Χ ο公式I所述測量未偶聯的抗體的量的方法可以為本領域常規的方法,如,通過紫外測定偶聯后的上清液中的蛋白濃度。
同樣地,抗體A和抗體B與固相載體偶聯的條件和步驟與上述三種抗體的條件和步驟相同。本發明提供裝載有上述免疫吸附劑的免疫親和柱。將免疫吸附劑制備成免疫親和柱的方法為本領域技術人員公知。例如,將上述清洗后的固相載體裝柱。所述含有0.001-0.1重量%的NaN3的PBS緩沖液(PBS緩沖液的組成為IL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g、12水合磷酸氫二鈉2.86g、氯化鉀0.2g、氯化鈉8.Sg)可以作為該免疫親和柱的保存液。裝柱的方法例如可以為:使用保存液制備漿液,以75%瓊脂糖凝膠和25%保存液的比例進行混合。以連續性的操作向柱內傾入漿液。使用一個斜靠在柱內壁上的玻璃棒進行填柱操作,將有助于減少氣泡的產生。填柱后,關閉親和柱下端的開口,并取下親和柱的頂端部件。仔細操作,加入保存液以充填親和柱的余下部分,以在親和柱的頂端形成一個向上的彎液面。將頂端篩板以一定的角度插入到親和柱中,確保在篩板的下方沒有空氣。將篩板鎖定在基質表面適當的位置上,打開親和柱下方的開口,用5倍柱床體積的無菌過濾的保存液過柱,并使用保存液保存,至此,親和柱已裝填并平衡完畢,可供直接使用??梢愿鶕绢I域的常規方法(如CN101059512A中公開的方法)計算免疫親和柱的動態柱容量(每毫升免疫吸附劑或柱床體積對待測物的最大吸收值)和絕對柱容量(每毫升固定抗體對待測物的最大結合容量)。結果表明所述本發明的免疫親和柱對黃曲霉毒素BpByGpG2JpM2和雜色曲霉素的動態柱容量和絕對柱容量分別為310ng/mL和860ng/mg,該免疫親和柱對玉米赤霉烯酮的動態柱容量和絕對柱容量分別為580ng/mL和1700ng/mg,該免疫親和柱對赭曲霉毒素A的動態柱容量和絕對柱容量分別為130ng/mL和580ng/mg ο使用了 5-10次以后柱容量為總柱容量的60-90%左右,保存期為1.5年。本發明提供含有上述免疫吸附劑或含有上述免疫親和柱的試劑盒;優選地,所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液,所述洗脫液優選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種,最優選為色譜級甲醇。所述保存液優選為含有0.001-0.1重量%的NaN3的PBS緩沖液。此外,該試劑盒中還可包括盒體、黃曲霉毒素131、132、61、62、]\11、]\12、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的標準品、洗滌液、海綿托架中的至少一種。其中,所述洗滌液可以為磷酸鹽緩沖液(即IL水中含有0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀、2.9g十二水合磷酸氫二鈉和8.Sg氯化鈉的溶液)或水;所述海綿托架上設有孔和凹槽,所述凹槽中裝有上述標準品溶液、裝有上述各種溶液的試劑瓶,以及裝有上述免疫吸附劑的IAC柱。當含有抗體A和抗體B時,本發明的上述免疫吸附劑、上述免疫親和柱、或上述試劑盒可應用于純化以及檢測玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N和赭曲霉毒素A中的至少一種。當含有抗體A、抗體B和抗體C時,本發明的上述免疫吸附劑、上述免疫親和柱、或上述試劑盒可以應用于純化以及檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a -ZOL, β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中的至少一種。具體地,本發明提供一種純化黃曲霉毒素B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的方法,該方法包括,使含有黃曲霉毒素K、B2、G1'G2、M1'M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮a-ZER、a-ZOL、β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON和赭曲霉毒素A的液體樣品通過上述含有抗體A、抗體B和抗體C的免疫親和柱,使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、至少部分雜色曲霉素、至少部分玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、Z0N和至少部分赭曲霉毒素A吸附至該免疫親和柱上,然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素BpByGpG2'M1'M2、至少部分雜色曲霉素、至少部分玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β -ZER、β -Z0L、ZAN、Z0N和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來,所述洗脫液優選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種,最優選為色譜純甲醇。該方法還可以包括在洗脫液洗脫之前,用洗滌液對免疫親和柱進行洗滌,以除去免疫親和柱上非特異性吸附的殘余的液體樣品。所述洗滌液可以為水、磷酸鹽緩沖液和10%甲醇中的至少一種。根據本發明,所述含有黃曲霉毒素B2、G1, G2、M1, M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的液體樣品可以為任何含有上述物質的液體樣品,優選為食品的液體提取物、飼料的液體提取物、生物樣品的液體提取物和中藥的液體提取物中的至少一種。所述食品包括但不限于谷類、調料、奶制品等,所述谷類包括但不限于花生、玉米、大豆和大米等,所述生物樣品包括但不限于血漿、肝、腎、肺和肌肉等。將所述食品、飼料、生物樣品和中藥制成液體提取物的方法可以為本領域常規的方法,例如,可包括以下步驟:稱取一定量的樣品,用50-80%的甲醇水溶液提取后,用定性濾紙過濾,將濾液用純水稀釋,再用玻璃纖維濾紙過濾。本發明還提供一種檢測黃曲霉毒素GyMpM2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON和赭曲霉毒素A的方法,該方法包括,(I)根據上述純化黃曲霉毒素GyMpM2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的方法,得到待測液,所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素BpByGpG2JpM2、至少部分雜色曲霉素、至少部分玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β-ZER、β-Z0L、ZAN、ZON和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來而得到的溶液;(2)使所述待測液進入檢測系統,并通過與標準品比較進行定性或定量檢測。本發明對于檢測的具體方式沒有特別的限定,可以是先收集得到待測液,然后再手動使待測液進行檢測系統,也可以為連用系統,使待測液自動進入檢測系統進行檢測。所述檢測系統可以為本領域常規的各種用于分析檢測的儀器,優選使用液相色
-1'TfeP曰。所述分析檢測的條件可以根據待檢測的物質的不同進行調整,調整的方法為本領域技術人員公知。例如,對于黃曲霉毒素BpByGpG2'Mp M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A,色譜條件可以為:①對于黃曲霉毒素B2、Gp G2、Μ。M2,流動相:甲醇-水(甲醇/水的體積為45: 55);檢測器:熒光檢測器,激發波長為360nm,發射波長為440nm;色譜柱:C-18柱(柱長為150mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);流速:0.8mL/min。②對于雜色曲霉素,流動相:甲醇-水(甲醇/水的體積為75: 25);檢測器:紫外檢測器波長:325nm ;色譜柱:C_18柱(柱長為250mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);流速:0.8mL/min。③對于玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ΖΟΝ,流動相:乙腈-水(乙腈/水的體積比為60: 40);檢測器:熒光檢測器,激發波長為274nm,發射波長為440nm ;色譜柱:C_18柱(柱長為150mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);流速:0.8mL/min。④對于赭曲霉毒素A,流動相:乙腈:水:乙酸(三者體積比為49.5: 49.5: I);檢測器:熒光檢測器,激發波長為333nm,發射波長為477nm ;色譜柱:C_18柱(柱長為250mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);流速:0.8mL/min。所述“與標準品比較”的方法可以為本領域的常規方法,例如,首先通過液相色譜對準確配置成一定濃度的標準品進行檢測,確定該標準品的特征峰位置以及峰面積(或峰高)與濃度之間的關系。然后,在同樣條件下對待測液進行檢測,通過與標準品出峰位置的比較,確認待測液中是否存在與標準品相同的物質,通過與標準品的峰面積(或峰高)的比較,確定待測液中與標準品相同的物質的含量。通過以下實施例對本發明進行更詳細的說明。實施例1本實施例用于制備玉米赤霉烯酮免疫原、黃曲霉毒素免疫原和赭曲霉毒素A免疫原(I)將5mg玉米赤霉烯酮ZON溶于4mL卩比唳中,加入3mg的O-羧甲基輕胺,在室溫下攪拌24h,之后真空干燥,用水溶解后調pH到8.0,用乙酸乙酯提取3次,脫水結晶。將結晶物溶于二氧六環中配成5mmol/L的溶液,稱取30mg BSA溶于2mL、0.05mol/L(pH 7.4)的PBS中。4°C下,將二者混合,再向其中緩慢滴加3mg的N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)和溶于0.5mL 二氧六環的溶液中的6mg的N,N’ - 二環己碳二亞胺(DCC),將所得混合物于室溫下攪拌反應24h,透析、離心、冷凍備用。得到玉米赤霉烯酮免疫原,即Z0N-BSA。(2)將4mg黃曲霉毒素B1溶于2mL丙酮中,加入40 μ L 10%的H2SO4,在56°C攪拌反應4h ;將反應所得產物蒸干后,加入5mL H2O,用25mL氯仿提取兩次,然后用20mL H2O洗滌有機層,保留有機層;蒸去有機溶劑,得黃色固體產物。取1.0mg所述黃色固體產物,向其中加入2mL 0.5%的BSA溶液(4mLPBS中溶解有20mg BSA),在 37°C下反應 30min ;加入 IOOyL 6.5mM 的 NaHB4,4°C 反應 30min ;加入 50 μ L
0.1N的HC1,除去過量的NaHB4。在4°C條件下,用PBS溶液透析3天。得到黃曲霉毒素免疫原,即黃曲霉毒素B1-BSA0(3) 2mg赭曲霉毒素A (OTA)加入到500 μ L丙酮中,加入4mg CDI,得到第一溶液。將8mg BSA加入到3mL 0.1M pH9.6的碳酸鹽緩沖液中,得到BSA溶液。把第一溶液慢慢滴加到BSA溶液中,室溫反應2天,反應后溶液在4°C條件下,用PBS溶液透析3天。得到赭曲霉毒素A免疫原,即0TA-BSA。實施例2本實施例用于制備抗玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ΖΑΝ、ZON的單克隆抗體(抗體Α)和抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體(抗體B)以及抗黃曲霉毒素Bp B2、Gp G2、MpM2和雜色曲霉毒素的單克隆抗體(抗體C)。(I)動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠。用玉米赤霉烯酮免疫原免疫5只小鼠。取玉米赤霉烯酮免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐劑,制成乳化劑進行免疫,之后佐劑改為不完全佐劑,共免疫6次,每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外,其余均為腹腔注射。免疫結束后處死小鼠,取脾細胞。細胞融合:將脾細胞和雜交瘤細胞按照10: I的比例進行細胞融合試驗。雜交瘤細胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,直到得到對玉米赤霉烯酮有很好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌玉米赤霉烯酮抗體的雜交瘤細胞CGMCCN0.5504,制備出單克隆抗體A。(2)動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右的雌性BALB/c小鼠,用赭曲霉毒素A免疫原免疫5只小鼠。取赭曲霉毒素A免疫原(100 μ g/只)加等量弗氏完全佐劑,制成乳化劑進行免疫,之后佐劑改為不完全佐劑,共免疫6次,每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外,其余均為腹腔注射。免疫結束后處死小鼠,取脾細胞。細胞融合:將脾細胞和雜交瘤細胞按照10: I的比例進行細胞融合試驗。雜交瘤細胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,直到得到對赭曲霉毒素A有很好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌赭曲霉毒素A抗體的雜交瘤細胞CGMCCN0.5505,制備出單克隆抗體B。(I)動物免疫:免疫動物為6-8周齡左右,雌性BALB/c小鼠。用黃曲霉毒素Bl-BSA免疫3只小鼠。取黃曲霉毒素Bl-BSA(100yg/只)加等量弗氏完全佐劑,制成乳化劑進行免疫,之后佐劑改為不完全佐劑,共免疫6次,每次間隔2周。除第一次為頸背部皮下多點注射外,其余均為腹腔注射。免疫結束后處死小鼠,取脾細胞。細胞融合:將脾細胞和雜交瘤細胞按照10: I的比例進行細胞融合試驗。雜交瘤細胞克隆化:采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞,直到得到對黃曲霉毒素和雜色曲霉毒素都有很好的特異性反應的細胞。最后篩選出分泌黃曲霉毒素和雜色曲霉毒素抗體的雜交瘤細胞CGMCC N0.5506,制備出單克隆抗體C。實施例3本實施例用于制備免疫親和柱1、瓊脂糖凝膠的制備稱取所需的Ig用CNBr活化的瓊脂糖凝膠粉末(商購自美國GE公司,每克凍干粉末可形成3.5ml終體積的溶脹瓊脂糖凝膠),溶于ImM HCl中。將立即溶脹的瓊脂糖凝膠置于燒結玻璃過濾器中,用ImM HCl洗滌15min。2、抗體偶聯(a)使用偶聯緩沖液(0.2M NaHCO3,pH8.3)溶解抗體,抗體為抗體A、抗體B和抗體C,其中,抗體A、抗體B和抗體C的濃度均為5.lmg/ml,抗體溶液體積為35ml,將抗體溶液置于冰浴中暫存。在一個帶蓋的可完全密封的容器中加入上述含有抗體的偶聯緩沖液,并迅速向其中加入步驟I洗漆好的瓊脂糖凝膠。室溫條件(20-25°C )下采用end-over-end的方式充分混勻上述的混和物2-4h,(b)計算偶聯率:在2,OOOrpm下離心步驟(a)得到的混合物,離心Imin,將瓊脂糖凝膠離心至管底,將上清液轉移至新的離心管中,測定上清液的蛋白質含量。通過公式I計算出抗體A、抗體B和抗體C的總偶聯率為99.8%,說明偶聯很成功。取離心至管底的瓊脂糖凝膠,使用偶聯緩沖液進行洗滌,除去多余的抗體。
(c)封閉:轉移固相載體至0.1M Tris-HCl緩沖液中,室溫條件下靜置2_4h,以封閉未偶聯的活性位點。(d)除去未偶聯上的多余的抗體,依次用低、高兩種pH的緩沖液對瓊脂糖凝膠進行洗滌,至少洗滌3個循環,每種緩沖液的使用量至少為瓊脂糖凝膠體積的5倍。每個洗滌循環步驟:先用0.1M醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH值為4.0)洗滌,接著再用
0.1M Tris-HCl緩沖液(pH值為8.0)進行洗滌。(e)用5倍瓊脂糖凝膠體積的含有0.01重量% NaN3的PBS洗滌,并使用含有0.01重量% NaN3的PBS溶液(保存液)保存。3、裝柱使用保存液制備漿液,以75%瓊脂糖凝膠和25%保存液的比例進行混合。以連續性的操作向柱內傾入漿液。使用一個斜靠在柱內壁上的玻璃棒進行填柱操作,將有助于減少氣泡的產生。填柱后,關閉親和柱下端的開口,并取下親和柱的頂端部件。仔細操作,力口入保存液充填親和柱的余下部分,以在親和柱的頂端形成一個向上的彎液面。將頂端篩板以一定的角度插入到親和柱中,確保在篩板的下方沒有空氣。將篩板鎖定在基質表面適當的位置上,打開親和柱下方的開口,用5倍柱床體積的無菌過濾的保存液過柱,并使用保存液保存,至此,親和柱已裝填并平衡完畢,可供直接使用。實施例4本實施例用于檢測 花生樣品中的黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ΖΑΝ、ZON和赭曲霉毒素A ;檢測牛奶樣品中的黃曲霉毒素M1和Μ2。1、利用添加回收實驗檢測花生樣品中的黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a -ZOL, β-ZER、β-Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A。(I)向花生樣品中分別添加終濃度為10μ g/kg,20l.! g/kg,50l.! g/kg三個濃度梯度的黃曲霉毒素G2,添加終濃度為10μ g/kg,200l.! g/kg,500l.! g/kg三個濃度梯度的玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN和Ζ0Ν,添加終濃度為10 μ g/kg, 20 μ g/kg,50 μ g/kg三個濃度梯度的雜色曲霉素,添加終濃度為10 μ g/kg,20 μ g/kg,50 μ g/kg三個濃度梯度的赭曲霉毒素A。每個實驗做五組平行試驗。(2)花生中黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2、玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-Z0L、β-ZER、β -ZOL, ΖΑΝ、ΖΟΝ、雜色曲霉素和赭曲霉毒素A的提取和檢測:準確稱取經過磨細(粒度小于2mm)的花生50.0g于250mL具塞錐形瓶中,加入
5.0g氯化鈉及準確加入100.0mL甲醇-水(甲醇/水體積比為8: 2),以均質器高速攪拌提取2min,或搖床震蕩30min。定量濾紙過濾,準確移取10.0mL濾液并加入40.0mL pH7.0的PBS溶液稀釋,用玻璃纖維濾紙過濾I 2次,至濾液澄清。將實施例3制得的免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL樣品提取液注入該玻璃注射器中,將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,調節壓力使樣品提取液以約6mL/min的流速緩慢通過免疫親和柱,直至2 3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次,棄去全部流出液,并使2 3mL空氣通過柱體。加入2.0mL色譜級甲醇洗脫,流速為l-2mL/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中,供檢測用。2、利用添加回收實驗檢測牛奶樣品中的黃曲霉毒素M1和M2
(I)向牛奶中分別添加終濃度為0.1 μ g/L,0.5 μ g/L,1.0 μ g/L三個濃度梯度的
黃曲霉毒素M1和仏。每個實驗做五組平行試驗。(2)提取和檢測牛奶中的黃曲霉毒素M1和M2準確量取50ml牛奶,在4000轉/分以上的轉速下離心15分鐘。去掉奶皮,取得脫脂奶,備測。將實施例3制得的免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。移取50.0mL脫脂奶注入該玻璃注射器中,將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,調節壓力使脫脂奶以約6mL/min的流速緩慢通過免疫親和柱,直至2 3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次,棄去全部流出液,并使2 3mL空氣通過柱體。加入2.0mL色譜級甲醇洗脫,流速為l_2mL/min,收集全部洗脫液于玻璃試管中,供檢測用。3、高效液相色譜條件黃曲霉毒素B1'B2、G1、G2、M1、M2:(a)流動相:甲醇-水(甲醇/水體積比為45: 55);(b)檢測器:熒光檢測器,激發波長為360nm,發射波長為440nm ;(c)色譜柱:C_18柱(柱長為150mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);(d)流速:0.8mL/min ;(e)光化學衍生化系統:光化學衍生池(連接于色譜柱后,然后通向熒光檢測器)。雜色曲霉素:
(a)流動相:甲醇-水(甲醇/水體積比為75: 25);(b)檢測器:紫外檢測器,波長為325nm ;(c)色譜柱:C_18柱(柱長為250mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);(d)流速:0.8mL/min。玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN 和 ZON:(a)流動相:乙腈-水(乙腈/水的體積比為60: 40);(b)檢測器:熒光檢測器,激發波長為274nm,發射波長為440nm ;(c)色譜柱:C_18柱(柱長為150mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);(d)流速:0.8mL/min赭曲霉毒素A:(a)流動相:乙腈:水:乙酸(三者體積比為49.5: 49.5: I);(b)檢測器:突光檢測器,激發波長為333nm,發射波長為477nm ;(c)色譜柱:C_18柱(柱長為250mm,內徑為4.6mm,填料直徑為5 μ m);(d)流速:0.8mL/min。4、定量用進樣器吸取50 μ L標準工作液注入高效液相色譜儀,在上述色譜條件下測定標準溶液的響應值(峰高或峰面積),得到黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2, M1, M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a -ZOL, β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A標準溶液的高效液相色譜圖。其中,黃曲霉毒素的譜圖見圖1(其中,Afla表示黃曲霉毒素),雜色曲霉素的譜圖見圖2,玉米赤霉烯酮同類物a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN和ZON的譜圖見圖3,赭曲霉毒素A的譜圖見圖4。根據與標準品的譜圖進行比較,對花生樣品和牛奶樣品中的黃曲霉毒素VB2JpGyMp M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物α-ZER、a-ZOL、β -ZER, β-ZOL、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A進行定量,測出經過免疫親和柱吸附和洗脫下的黃曲霉毒素B2、Gp G2、Μ。M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER, β-Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的含量,并根據公式II計算添加回收率。
權利要求
1.一種免疫吸附劑,其特征在于,該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯的抗體,所述抗體包括由雜交瘤細胞株CGMCC N0.5504分泌得到的單克隆抗體和由雜交瘤細胞株CGMCC N0.5505分泌得到的單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的免疫吸附劑,其中,所述抗體還包括由雜交瘤細胞株CGMCCN0.5506分泌得到的單克隆抗體。
3.裝載有權利要求1或2所述的免疫吸附劑的免疫親和柱。
4.含有權利要求1或2所述的免疫吸附劑或含有權利要求3所述的免疫親和柱的試劑盒,優選地,所述試劑盒中還包括洗脫液和/或保存液,所述洗脫液優選為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種,所述保存液優選為含有0.001-0.1重量%的NaN3的PBS緩沖液。
5.權利要求1所述的免疫吸附劑,引用權利要求1時權利要求3所述的免疫親和柱、或引用權利要求1時權利要求4所述的試劑盒在純化以及檢測玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β-ZER、β-Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中至少一種中的應用。
6.權利要求2所述的免疫吸附劑、引用權利要求2時權利要求3所述的免疫親和柱、或引用權利要求2時權利要求4所述的試劑盒在純化以及檢測黃曲霉毒素M2、雜色曲霉素、玉米赤霉 烯酮同類物α-ZER、a -ZOL, β-ZER、β-Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A中至少一種中的應用。
7.一種純化黃曲霉毒素G2、MpM2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的方法,該方法包括,使含有黃曲霉毒素B^ByG1'G2 J1J2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物 a -ZER、a -ZOL, β -ZER、β _Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的液體樣品通過引用權利要求2時權利要求3所述的免疫親和柱,使得所述液體樣品中的至少部分黃曲霉毒素B2、Gp G2、M1, M2、至少部分玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A吸附至該免疫親和柱上,然后用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素G2、MpM2、至少部分玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β-ZER、β _Z0L、ZAN、ZON、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來。
8.根據權利要求7所述的方法,其中,所述洗脫液為甲醇、乙腈和丙酮中的至少一種。
9.根據權利要求7或8所述的方法,其中,所述含有黃曲霉毒素B2、GpG2、Mp M2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER, β _Z0L、ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的液體樣品優選為食品的液體提取物、飼料的液體提取物、生物樣品的液體提取物和中藥的液體提取物中的至少一種。
10.一種檢測黃曲霉毒素BpByGpGyMpM2、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a -ZOL, β -ZER、β -ZOL, ZAN、ZON和赭曲霉毒素A的方法,該方法包括, (1)根據權利要求7-9中任意一項所述的方法,得到待測液,所述待測液為用洗脫液將所述至少部分黃曲霉毒素K、B2, G1, G2, M1, M2、至少部分玉米赤霉烯酮同類物a-ZER、a-ZOL、β-ZER、β-ZOL、ZAN、ZON、至少部分雜色曲霉素和至少部分赭曲霉毒素A洗脫下來而得到的溶液; (2)使所述待測液進入檢測系統,并通過與標準品比較進行定性或定量檢測。
全文摘要
本發明公開了一種免疫吸附劑,該免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯的抗體,所述抗體包括由雜交瘤細胞株CGMCC NO.5504分泌得到的單克隆抗體和由雜交瘤細胞株CGMCC NO.5505分泌得到的單克隆抗體。本發明還本發明還提供含有上述免疫吸附劑或免疫親和柱的試劑盒。以及上述免疫吸附劑、免疫親和柱、試劑盒在檢測黃曲霉毒素、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮同類物和赭曲霉毒素A中的應用。并具體提供了分離方法和檢測方法。本發明通過開發出性能穩定、特異的單克隆抗體,實現了對6種黃曲霉毒素、雜色曲霉素、6種玉米赤霉烯酮同類物和赭曲霉毒素A的同時純化和檢測。
文檔編號C07B63/00GK103157439SQ20111041043
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者鮑蕾, 呂寧, 許艷麗, 韓深, 劉巖, 梁成珠, 王雄, 果旗, 江帆, 王麗, 李峻峰, 戚大海, 吳兆廣 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 北京中檢維康技術有限公司
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