一種靶向藥物載體及其制法與應用

文檔序號:10544150
一種靶向藥物載體及其制法與應用
【專利摘要】本發明提供了一種靶向藥物載體及其制備方法與應用,該靶向藥物載體是通過將原發腫瘤細胞在體外培養并破碎后,取同源腫瘤細胞膜,將其包被于納米粒子表面獲得。本發明還提供了該靶向藥物載體的制藥用途,將本發明的靶向藥物載體通過靜電吸附或者共價偶聯方法負載DNA、RNA、多肽等藥物分子,制備獲得的靶向藥物制劑能夠高度特異性的攻擊母體病人身體內的癌細胞,而對正常細胞沒有殺傷作用,是一種高效的靶向腫瘤藥物。本發明的靶向藥物載體通過同源腫瘤細胞膜識別病人腫瘤細胞表面靶標分子,達到納米粒子特異性結合腫瘤細胞、靶向藥物傳輸至腫瘤細胞的功能,在腫瘤早期診斷、生物醫學成像、以及靶向藥物治療方面具有廣闊應用前景。
【專利說明】
一種靶向藥物載體及其制法與應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種基于同源腫瘤細胞膜靶向識別腫瘤細胞的納米藥物載體材料及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]癌癥是一類引起人類死亡的主要疾病,每年全球因癌癥死亡人數大約為700萬。隨著細胞生物學的發展以及對癌癥發病機制的了解,癌癥的藥物治療得到了很好的發展。目前大約有多種化學藥物及抗體藥物發展用于殺死腫瘤細胞和癌癥治療。但是這些藥物缺乏靶向特異性,在臨床上通常給患者帶來致命的副作用。同時,抗體藥物在體外抗腫瘤實驗中都取得了比較好的結果,但是一旦應用于體內,就會被人體內的免疫系統所清除;而體外對藥物進行修飾后,雖然可以部分逃避人體免疫系統的清除,但是又改變了作用機理。因此需要發展既能靶向攜帶藥物攻擊腫瘤細胞,又能逃避人體免疫系統的靶向載體。
[0003]同時,由于腫瘤的異質性,同一種癌癥病人的癌細胞存在差異。例如,同樣是肺癌患者,對病人A有效的藥物,對病人B可能就沒有作用。要能夠對不同的癌癥病人進行個體化的治療,需要篩選單個病人的癌細胞靶標,這是極其昂貴且耗時的工作,沒有商業化價值?,F有的靶向腫瘤藥物一般通過特異性抗體進行腫瘤細胞的識別,特異性抗體存在幾個問題:第一,目前有些腫瘤還沒有找到特異性抗體,無法通過特異性抗體進行靶向識別;第二,由于腫瘤的異質性,特異性抗體無法識別某些腫瘤亞型。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種靶向識別腫瘤細胞的同源細胞膜藥物載體。
[0005]本發明提供的一種靶向藥物載體,其為納米粒子表面包被同源腫瘤細胞膜得到的納米顆粒。
[0006]所述納米粒子為下列之一:量子點、磁性納米粒子、金納米粒子、聚乳酸乙醇酸、脂質體或明膠。
[0007]所述納米粒子粒徑為5-100nm。
[0008]所述同源腫瘤細胞膜為原發腫瘤細胞傳代培養得到的腫瘤細胞的細胞膜。
[0009]本發明提供了上述靶向藥物載體在制備靶向藥物中的應用。
[0010]優選地,所述靶向藥物載體通過靜電吸附或者共價偶聯方法負載藥物分子,制備靶向藥物。靶向藥物結構示意圖見圖1。
[0011 ] 優選的,所述藥物分子為DNA、siRNA、mRNA、多肽分子或抗體。
[0012]本發明提供了上述靶向藥物載體在制備腫瘤診斷試劑盒中的應用。
[0013]本發明提供了上述靶向藥物載體在生物醫學成像中的應用。
[0014]本發明還提供了上述靶向藥物載體的制備方法,包括以下步驟:
[0015](I)將原發腫瘤細胞體外培養獲得同源腫瘤細胞;
[0016](2)將同源腫瘤細胞離心、清洗、裂解、去除雜質得到同源腫瘤細胞膜囊泡;
[0017](3)在納米顆粒表面包被同源腫瘤細胞膜囊泡即得。
[0018]上述方法中,步驟(I)的同源腫瘤細胞是通過收集癌癥患者手術切除的癌組織樣品獲得,具體為,清洗組織樣品,然后去除組織樣品中殘留的脂肪;將組織樣品用消化液消化;消化后的組織離心去上清,將細胞沉淀重懸于0.25%胰酶-EDTA中消化;加入含10%胎牛血清的DMEM培養基,離心去上清;加入溫水浴的分散酶和DNaseI,用槍頭反復吹打樣品;再加入含10 %胎牛血清的DMEM培養基,用過濾器過濾細胞懸液,收集過濾后的細胞懸液,離心去上清;重懸細胞沉淀于培養基中,接種于培養瓶培養,得到人同源腫瘤細胞。
[0019]上述方法中,步驟(2)是將同源腫瘤細胞離心、清洗、裂解、去除雜質得到同源腫瘤細胞膜囊泡,具體地,將培養的同源腫瘤細胞離心(100G-2000G),在培養瓶中完全貼壁,然后清洗;將同源腫瘤細胞在低滲裂解液中裂解,離心(2000G-5000G)分離去除雜質,留下純化后的細胞膜;用壓力(0.01MP-10MP)多次將純化后的同源腫瘤細胞膜擠過納米孔濾膜(50nm-5000nm)獲得同源腫瘤細胞膜囊泡。
[0020]其中,上述將同源腫瘤細胞在低滲裂解液中裂解,進行離心時,整個溶液離心(2000G-5000G) 15_25次,每次3_8分鐘。優選地,3200g離心20次,每次5分鐘。
[0021]在本發明的實施例中,采用的納米孔濾膜品牌為AvantiPolar Lipids。
[0022]上述方法中,步驟(3)是將納米顆粒和制備的同源腫瘤細胞膜囊泡混合,用壓力多次將混合物擠過納米孔濾膜,對混合物離心以除去過量的同源腫瘤細胞膜,獲得同源腫瘤細胞膜包裹的納米顆粒。
[0023]步驟(3)中,納米顆粒和制備的同源腫瘤細胞膜囊泡按照質量比1:100-100:1混合?;旌衔镫x心條件為500G-50000G。
[0024]步驟(3)所述壓力為0.01MP-10MP,納米膜孔徑為50-5000nm。
[0025]優選地,納米膜孔徑為20-2000nm。
[0026]同源腫瘤細胞是腫瘤病人原發位點癌細胞系,其從腫瘤病人的病灶部位取一小部分腫瘤細胞,進行體外培養獲得。由于癌細胞的特性,癌細胞膜上面存在靶標分子,使得癌細胞相互之間能夠互相識別。這樣就不需要進行癌細胞靶標的篩選,癌癥病人自身的癌細胞膜就是最好的靶標。將所述體外培養的癌細胞破膜,獲取同源腫瘤細胞膜,然后將同源腫瘤細胞膜包裹在納米材料上。這種同源腫瘤細胞膜包裹的納米材料有非常高的特異性。能高度特異性的識別母體病人的癌細胞。將所述的同源腫瘤細胞膜作為載體材料,通過靜電吸附或者共價偶聯方法負載藥物分子,制備獲得的靶向藥物制劑,能夠高度特異性的攻擊母體病人身體內的癌細胞,而對正常細胞沒有殺傷作用,是一種高效的靶向腫瘤藥物。
[0027]本發明通過同源腫瘤細胞膜識別病人腫瘤細胞表面靶標分子,達到納米粒子特異性結合腫瘤細胞、靶向藥物傳輸至腫瘤細胞的功能,在腫瘤早期診斷、生物醫學成像、以及靶向藥物治療方面具有廣闊應用前景。生物利用度實驗顯示沒有明顯的藥理毒性、同時小鼠成像實驗證實其具有特別優異的靶向性能。
【附圖說明】
[0028]圖1為腫瘤靶向藥物結構示意圖,圖中a為腫瘤細胞靶向分子;b為同源腫瘤細胞膜;c為納米粒子;d為偶聯的藥物分子。
[0029]圖2為腫瘤靶向藥物載體材料制備方法流程圖。
[0030]圖3為腫瘤靶向藥物載體材料透射電鏡圖片。其中a為未包裹同源腫瘤細胞膜的納米粒子;b為包裹了同源腫瘤細胞膜的靶向藥物載體。
[0031]圖4為腫瘤靶向藥物載體材料生物利用度數據圖。注射30天后,所有的小白鼠會被實施安樂死,它們的血液和主要器官會被收集起來,用于進行血液生化及血液檢查,和組織病理學分析。結果發現,的血液系數、血液生化顯性(丙谷轉氨酶ALT,谷草轉氨酶AST,堿性磷酸酶ALP,血漿尿素氮BUN,肌氨酸酐CRE)等方面無明顯區別。
[0032]圖5為蘇木精-伊紅染色的組織病理學切片圖對比組和用藥組的心,肝,脾,肺,腎組織病理切片圖,圖片顯示用藥組小組的組織未發現明顯的組織損傷。
[0033]圖6為腫瘤靶向藥物載體材料靶向特異性的小鼠實驗顯示圖。其中a圖為患腫瘤的小鼠,圓圈處為腫瘤部位,b圖為注射實施例1制得的靶向載體MDA-UCNPs后,圓圈處顯示藥物在腫瘤部位富集。
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限于此。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購自Thermo-Fisher(美國)。(EDTA),多聚甲醛(PFA),4’,6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),細胞計數試劑盒_8(CCK8)和乙酸雙氧鈾購自Sigma-Aldrich公司(美國)Jris-HCl (pH值=7.5)和無EDTA迷你蛋白酶抑制劑片劑從Mediatech公司(美國)和Roche獲得(瑞士)。磷脂購自Avanti (美國)。在這項工作中所使用的其它試劑購自拉丁試劑(中國)。
[0035]實施例1肺癌病人的同源腫瘤細胞膜載體的制備與效果
[0036]1、肺癌病人同源腫瘤細胞膜載體的制備
[0037]如圖2所示,同源腫瘤細胞膜載體的制備包括3個步驟:
[0038](I)將原發腫瘤細胞體外培養獲得同源腫瘤細胞;
[0039](2)將同源腫瘤細胞破碎得到同源腫瘤細胞膜囊泡;
[0040](3)在納米顆粒表面包被同源腫瘤細胞膜囊泡即得同源腫瘤細胞膜載體。
[0041 ]步驟(I)具體為:
[0042]I)收集癌癥患者手術切除的癌組織樣品;
[0043]2)清洗組織樣品,然后去除組織樣品中殘留的脂肪;
[0044]3)將組織樣品用消化液消化;
[0045]4)消化后的組織離心去上清,將細胞沉淀重懸于0.25%胰酶-EDTA中消化;
[0046]5)加入含10%胎牛血清的DMEM培養基,離心去上清;
[0047]6)加入溫水浴的分散酶和DNase I,用槍頭反復吹打樣品;
[0048]7)再加入含10%胎牛血清的DMEM培養基,用過濾器過濾細胞懸液,收集過濾后的細胞懸液,離心去上清;
[0049]8)重懸細胞沉淀于培養基中,接種于培養瓶培養,得到人同源腫瘤細胞。
[0050]步驟(2)具體步驟為:
[0051 ] I)將同源腫瘤細胞通過在800g離心5分鐘,在T-175培養瓶中完全貼壁,然后用含2mM EDTA的PBS緩沖液清洗3次。
[0052]2)將細胞懸浮在低滲裂解緩沖液(20mM的Tris-HCl,1mM氯化鉀,2mM的MgC12和ImM無EDTA迷你蛋白酶抑制劑)中并混合均勻。整個溶液進行20次離心(3200g,每次5分鐘),離心參數根據細胞膜的密度來選擇,以獲得最優的分離效率。將離心后上清液保存,將沉淀物重新懸浮在低滲裂解緩沖液,并進行另外20次離心。和保存的上清液混勻,并離心(20000g 30分鐘),之后,棄去沉淀,上清液用超高速離心機(LE-80K,貝克曼庫爾特,USA),再離心(80000g 1.5小時)。然后用10毫摩爾Tris-HCl和ImM EDTA中洗滌沉淀的細胞膜。將最終的沉淀物收集作為純化后的同源腫瘤細胞膜。
[0053]3)將純化癌癥細胞膜擠入納米孔濾膜(50nm-5000nm,AvantiPolar Lipids,USA),重復物理擠壓多次(壓力0.01MP-10MP),從而獲得同源腫瘤細胞膜囊泡。
[0054]步驟(3)在納米顆粒(UCNPs)表面包被同源腫瘤細胞膜囊泡
[0055]I)要在UCNPs上包裹癌細胞膜,先將I毫升的PBS(含50微克UCNPs)和制備的同源腫瘤細胞膜(50微克)混合。
[0056]2)隨后將上述混合物通過20nm-2000nm的納米孔擠出多次,壓力0.01MP-10MP。
[0057]3)然后在100G-5000G下對混合物離心以除去過量的同源腫瘤細胞膜。最后,將得到的同源腫瘤細胞膜包裹顆粒(CC-UCNPs)放在PBS過夜。圖3制備得到的同源腫瘤細胞膜包裹顆粒的透射電鏡圖片。
[0058]2、肺癌病人同源腫瘤細胞膜載體的安全性實驗
[0059]如圖4所示,為藥物的生物利用度實驗數據,血生化指標分析顯示,實驗中,實驗室小白鼠(兩只)的靜脈被分別注射:I.200毫升的PBS; 2.MDA細胞膜(MDA細胞是肺癌細胞)包裹上轉換熒光納米材料(MDA-UCNPs),即上面步驟I制備得到的同源腫瘤細胞膜包裹顆粒。(上述處理I是對照組,處理2是用藥組)
[0060]對于體內毒性而言,體重波動是一個直接顯征。在對用藥組和對比組兩組進行為期30天的觀察后,既無死亡病例也無體重的明顯變化,說明用藥組和對比組對小白鼠沒有副作用。值得注意的是,用藥組(注射了MDA-UCNPs)后,不會讓免疫力缺乏的實驗室小白鼠患上腫瘤。注射30天后,所有的小白鼠會被實施安樂死,它們的血液和主要器官會被收集起來,用于進行血液生化及血液檢查,和組織病理學分析。結果發現,用藥組和對比組的血液系數、血液生化顯性(如丙谷轉氨酶ALT,谷草轉氨酶AST,堿性磷酸酶ALP,血漿尿素氮BUN,肌氨酸酐CRE)等方面無明顯區別(圖4的a,b,c圖)。與此同時,在蘇木精-伊紅染色的切片(圖5)中,未觀察到明顯的組織損傷等特征,上述所有結果都顯示腫瘤細胞膜包裹的納米材料沒有明顯的生物毒性。
[0061 ] 3、同源腫瘤細胞膜載體藥物靶向特異性實驗
[0062]如圖6所示,為藥物靶向特異性實驗數據,為了證實所述納米載體藥物對腫瘤的靶向特異性,進行了小鼠體內上轉換發光(UCL)成像實驗,32只BALB/c裸鼠分別進行MDA-MB-435腫瘤異種移植,然后分為用藥組和對比組接受靜脈內注射:對比組注射200微升的PBS;用藥組注射含有納米顆粒(即,MDA細胞膜包裹發光納米(UCNPs)顆粒:MDA-UCNPs)的PBS溶液(濃度為5mg/ml)。在注射后24小時,所有的小鼠通過腹膜內(IP)注射80微升1 %水合氯醛溶液麻醉,然后在小鼠UCL成像成像系統(Xenogen IVIS Spectrum,Caliper,美國)上拍照,成像系統配備熒光濾光片(激發/發射=53511111/98011111),視場為12.5厘米,曝光時間為1秒。圖6顯示,藥物主要在腫瘤附近高濃度富集,證實具有較好的腫瘤靶向性。小鼠實驗證實,MDA-UCNPs納米顆粒具有極好的腫瘤靶向特異性,其在裸鼠腫瘤部位富集,是非常好的腫瘤靶向藥物載體。
【主權項】
1.一種靶向藥物載體,其特征在于,其為納米粒子表面包被同源腫瘤細胞膜得到的納米顆粒。2.如權利要求1所述的靶向藥物載體,其特征在于,所述納米粒子為下列之一:量子點、磁性納米粒子、金納米粒子、聚乳酸乙醇酸、脂質體或明膠。3.如權利要求2所述的革E向藥物載體,其特征在于,所述納米粒子粒徑為5-100nm。4.權利要求1-3任一所述的靶向藥物載體在制備靶向藥物中的應用。5.權利要求1-3任一所述的靶向藥物載體在制備腫瘤診斷試劑盒中的應用。6.權利要求1-3任一所述的靶向藥物載體在生物醫學成像中的應用。7.權利要求1-3任一所述的靶向藥物載體的制備方法,其特征在于,包括以下步驟: (1)將原發腫瘤細胞體外培養獲得同源腫瘤細胞; (2)將同源腫瘤細胞離心、清洗、裂解、去除雜質得到同源腫瘤細胞膜囊泡; (3)在納米顆粒表面包被同源腫瘤細胞膜囊泡即得。8.如權利要求8所述的制備方法,其特征在于,步驟(3)是將納米顆粒和制備的同源腫瘤細胞膜囊泡混合,用壓力將混合物擠過納米孔濾膜,再對混合物離心以除去過量的同源腫瘤細胞膜,獲得同源腫瘤細胞膜包裹的納米顆粒。9.如權利要求8所述的制備方法,其特征在于,納米顆粒和制備的同源腫瘤細胞膜囊泡按照質量比1:100-100:1混合。10.如權利要求8所述的制備方法,其特征在于,所述壓力為0.01MP-10MP,納米膜孔徑為50_5000nm。
【文檔編號】A61K9/50GK105903037SQ201610338277
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】劉威
【申請人】劉威
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