一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑的制作方法

文檔序號:628934
專利名稱:一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑的制作方法
技術領域
本發明涉及抗血栓藥物,特別提供一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑。
背景技術
隨著血栓栓塞性疾病患者的增加,抗血栓藥物的研制已成為熱點之一,人們一方面采用分子生物學技術對現有藥物進行分子結構改造,以期獲得更為優良的溶栓藥物。另一方面,積極的尋找一些安全性好、療效好、副作用小的天然來源的溶栓藥物。蛇毒是含有多種生物活性蛋白和多肽的混合物,含有多種抗栓成分。自20世紀60 年代,人們陸續開發了一些具有抗栓作用的蛇毒制劑1976年hnouf從馬來西亞紅口蝮蛇毒中純化出凝血酶樣酶或稱類凝血酶(Thrombin-likeEnzymes TLEs),制成了第一個治療血栓病的蛇毒制劑Ancord。迄今為止,已從蛇毒中分離出多種溶栓物質,部分已用于臨床。 如東菱克栓酶、降纖酶及蘄蛇酶等,獲得了較好的臨床療效。目前從蛇毒中分離的抗栓物質根據其作用機制、分子結構等的不同,分為類凝血酶、纖溶酶及纖溶酶原激活劑等幾大類。自1936年奧地利學者Von Klobusitzky首次從巴西矛頭蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分離得到一種絲氨酸蛋白水解酶(類凝血酶),也就是所說的巴曲酶。至今已發現30 多種蛇毒中含有類凝血酶組份,并有20多種先后得到分離和純化。我國目前臨床上應用的蛇毒制劑大部分為類凝血酶,如東菱克栓酶、蘄蛇酶及降纖酶等。在臨床上有兩方面的用途。一為降纖作用,即巴曲克栓酶,如東菱迪芙(來自于Bothrops moojeni),其作用是分解纖維蛋白原,抑制血栓形成;誘發組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑(t-pa)的釋放, 減弱纖維蛋白溶解酶原激活劑的抑制因子的活性,促使纖維蛋白溶解;增加血液流動性,防止血栓形成;降低血管阻力,加快血液流速,改善微循環。主要用于腦梗塞、血栓閉塞性脈管炎、股動脈栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。目前,巴曲克栓酶注射液在臨床上已廣泛用于多種疾病的治療,包括缺血性腦血管病、急性心肌梗塞、突發性耳聾、急性腦梗塞、難治性腎病綜合癥、糖尿病性周圍神經病、肺源性心臟病、不穩定心絞痛、高粘血癥、心源性腦栓塞, 其療效確切,不良反應輕微。二為止血作用,即巴曲止血酶,如立止血,也稱蛇毒血凝酶(來自于Bothrops atrox),可用于多種原因引起的出血,特別是應用于傳統止血藥無效的出血病人,療效確切,未發現明顯的不良反應。類凝血酶對纖維蛋白原的作用較凝血酶更為專一,大部分蛇毒類凝血酶僅裂解纖維蛋白肽A,部分還同時裂解B肽。類凝血酶不會激活F X III,所產生的纖維蛋白聚合物分子間只在頭尾連接。因此,不能使纖維蛋白發生交聯,不交聯的纖維蛋白對體內的纖溶酶較敏感,易受其分解,降解為無活性的小肽,在體內可迅速的被網狀內皮系統及腎臟清除, 從而使纖維蛋白原濃度下降,出現抗凝效果。在體內,類凝血酶則可以消耗纖維蛋白原,降低血液粘度,從血流變學方面改善微循環,從而起到抗栓的作用。而多數的類凝血酶不激活血小板,也不激發血小板的釋放反應,亦不引起血塊收縮,僅少數在高濃度下引起血小板的聚集,有的TLEs還可阻止凝血酶誘導的血小板聚集效應,同時對由ADP-Na、膠原及腎上腺素等血小板聚集誘導劑所誘導的血小板聚集有同樣的抑制效應。這些可能是類凝血酶防治血栓癥的另一重要藥理學基礎。 蛇毒類凝血酶現已廣泛應用于臨床,并取得明顯的臨床效果,但仍有很多問題未解決一是蛇毒類凝血酶制劑作為一種生物制品,存在抗原性,偶有過敏反應出現,且多次應用后易產生相應的抗體,從而降低制劑的療效;二是蛇毒的來源有限,不利于大規模生產,同時價格較高,不利于其廣泛應用;三是類凝血酶是從蛇毒中純化得到的,純度難以控制,從而增加了毒副作用。解決這些問題的辦法是借助基因重組技術,在實驗室中進行表達,但這些必須在對蛇毒類凝血酶的結構及性質作更深入的研究后方可進行。成熟的巴曲酶分子是由231個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白,其氨基畫?序列如下1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEffVLTAA41HCNRRFMRIHLGKHAGSVANYDEVVRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGffGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVLQGGIDTCG⑶SGG PLICNGQFQGILSffGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPffIQSIIAGNKTATCP其DNA序列如下1STCATTGGAG GTGATGAATG TGACATAAAT GAACATCCTT TCCTTGCATT CATGTACTAC61rCTCCCCGGT ATTTCTGTGG TATGACTTTG ATCAACCAGG AATGGGTGCT GACCGCTGCA121CACTGTAACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGTAAACATGCCGGAAGTGTAGCAAAT181TATGATGAGGTGGTAAGATACCCAAAGGAGAAGTTCATTTGTCCCAATAAGAAAAAAAAT241GTCATAACGGACAAGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCAAAAACAGTGAA301CACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAACCCTCCCAGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATT361ATGGGATGGGGCGCAATCACAACTTCTGAAGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT421AACATTAACCTGTTCAATAATACGGTGTGTCGTGAAGCTTACAATGGGTTGCCGGCGAAA481ACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGA541CCCCTCATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGTGATCCCTGTGCC601GAACCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCAAGGTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGC661ATTATTGCAGGAAATAAAACTGCGACTTGCCCG理論計算出其分子量為25. 5KD,等電點為7. 39,國夕卜從Bothrops atrox毒液中
提取的巴曲酶,其實際分子量為42KD,這種分子量的偏差是由于糖基化修飾的緣故。從巴曲酶蛋白質一級結構中可以發現,其分子內有兩個N-糖基化位點=Asni46-Asn147-Thrx和 Asn225-Lys226-Thi^8。此外,Bothropsatrox的其他亞種以及其他種類毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白,不過其分子量從四.IKD到42KD不等,這可能是由于不同亞種之間氨基酸組成上差別或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12個半胱氨酸,根據已知的絲氨酸蛋白酶類分子的研究結果,推測這12個半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、 cys26-cys42、cys74-cys23°、cys118-cys184、cys15°-cys163、cysm-cys199 六個分子內二硫鍵的形成 (Itoh n.et al· The J. of BiologicalChemistry,262,3132,1987)。
考慮到進口蛇毒原料成本較高,同時,巴西矛頭蝮蛇是稀有的保護蛇種,蛇毒產量有限。因此,我們采用基因工程的方法大量生產重組巴曲酶,我們首先構建了表達天然巴曲酶的基因工程菌種,但發現在發酵表達時,目的蛋白有嚴重的降解現象,這就極大地影響了巴曲酶的產量。因此,我們對巴曲酶進行定點突變,將巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位點進行突變,避免其對發酵液中所表達的巴曲酶的降解,同時還不影響巴曲酶的凝血活性, 這將極大地提高巴曲酶的產量,更好地滿足研究和臨床應用的需要。巴曲酶蛋白雖然只有一條肽鏈,但是由于分子內二硫鍵多,還有糖基化修飾等,所以采用基因工程手段生產這種蛋白有很大的技術難度。這也是一直沒有重組產品問世的主要原因之一。雖然研究者對天然巴曲酶的性質有比較多的了解,但是,對其分子生物學方面的研究一直進展緩慢,直到1987、1988年才由日本的研究者完成對巴曲酶基因的cDNA和基因組 DNA 測序工作(Nobuyuki Itoh etalj. Biol. Chem. 262(7) :3132-3135,1987 ;J. Biol. Chem.,263 :7628-7631,1988) Maeda M等采用基因重組方法,在Ε. coli中,采用融合表達系統,以包涵體(Inclusion Body)的形式表達出該成份,據報道得到了所謂有生物學活性巴曲酶(Maeda M. etal, J Biochem(Tokyo), 109(4) :632_637,1991),而且還為此申請了專利(Pat, No. JP2124092,1990)。在E.coli中表達某些蛋白已經是較為常規的生產藥用蛋白的基本手段,但是在對蛇毒類凝血酶實際研究中發現,在E. coli中表達蛇毒類凝血酶的量很少。潘華等采用 RT-PCR法擴增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒類凝血酶基因I^allas,以表達載體pET-24a(+)構建T-7啟動子控制下的表達質粒pET-Pallas,轉化E. coli BL21 (DE3), 并用0. 4mmol/L IPTG誘導表達,經SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析表明有生物活性的 Pallas表達(潘華等,蝮蛇類凝血酶基因的分析及表達研究,生物化學與生物物理學報, 1999,31,79)。Fan等采用PCR法擴增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒類凝血酶基因 Acutin,克隆到表達載體pET-Ma,在E. coli BL21DE(3)中表達,經SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析表明有生物活性的Acutin表達(Fan C. Y.等,Biochemistry and Molecular Biology International, 1999,47,217)。但它們的表達效率普遍較低,沒有實際生產價值。楊青等報道了用甲醇酵母表達Gussurobin,獲得每升發酵液產IOmg有活性的 Gussurobin (楊青等,Biotechnology Letters, 2002, 24,135) ;Weon-KyooYou 等報道了用甲醇酵母表達Batroxobin,獲得了每升發酵液產13. 16mg有活性的Batroxobin (Weon-Kyoo You 等,FEBS Letters,2004,571,67)。上海萬興生物制藥有限公司申請了基因工程表達Batroxobin的專利(公開號CN1534093A,2004),在大腸桿菌和甲醇酵母中均獲得表達,但在大腸桿菌中表達的 Batroxobin均為無活性蛋白。在甲醇酵母中獲得一定量Batroxobin的表達,產量達每毫升發酵液20克氏單位(20KU/ml),這一產量已初步具備生產意義。上述研究結果表明利用基因工程方法生產蛇毒類凝血酶是可行的,但要用真核表達系統。到目前為止,Batroxobin 的基因工程產品還沒有上市。采用基因工程的手段生產富含多對二硫鍵的蛋白一直是一個技術難題,尤其是生產有六對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶。這是因為二硫鍵配對錯誤率很高,在原核中得到的幾乎全是包涵體,雖然對包涵體的變性復性能得到少量的有活性的目的蛋白,但是其成本決定了不具備實際生產意義。真核表達系統(酵母、CHO和昆蟲細胞等)能保證較高的二硫鍵配對正確率。另外,蛇毒類凝血酶分子中有不同含量的糖基化,原核細胞不能對所表達的外原蛋白進行糖基化,而糖基對蛋白的空間結構和酶活性都起穩定作用。因此空間結構復雜、有糖鏈的蛋白本身就不適合用原核細胞進行表達。而真核表達系統除能保證較高的二硫鍵配對正確率外,還能對表達產物進行一定程度的糖基化,雖然糖基化的含量和種類與蛇毒中類凝血酶分子所含的糖基不同,但也很好地保證了表達產物的活性。

發明內容
本發明的目的在于提供一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,該凍干制劑活性穩定,安全有效,節約成本,便于運輸和保存。本發明具體提供了一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,其特征在于該制劑含有重組定點突變巴曲酶、賦形劑以及凍干保護劑,其比例為,巴曲酶賦形劑保護劑 =IOBU 10 IOOmg 0. 1 5mg,優選為巴曲酶賦形劑保護劑=IOBU 30 70mg 1 4mg。其中重組定點突變巴曲酶的氨基酸序列相對于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45 位的Arg突變為Lys,具體為1 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEffVLTAA41 HCNRKFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGffGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCG⑶SGG PLICNGQFQG ILSffGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPffIQS IIAGNKTATC P該重組定點突變巴曲酶能夠通過以分泌表達的方式大量生產獲得,同時具有較高的生物活性。它可以通過將人工合成的定點突變的巴曲酶結構基因在酵母菌細胞中,以分泌表達的方式大量產生獲得,優選通過甲醇酵母菌以分泌表達的方式大量產生獲得。本發明提供的重組定點突變巴曲酶,在甲醇酵母菌中實現分泌表達時,可以依據巴曲酶的天然氨基酸序列,選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子,人工合成定點突變的巴曲酶結構基因序列,再將人工合成的定點突變的巴曲酶結構基因重組到甲醇酵母菌表達載體
pPICZa中。
本發明人工合成定點突變的巴曲酶結構基因序列最好為
1GTTATTGGTGGTGATGAATGTGATATTAACGAACATCCATTTITGGCTIT
51TATGTACTACTCTCCAAGATACTTTTGTGGTATGACTITGATTAACCAAG
101AATGGGTTTTGACTGCTGCTCATTGTAACAGAAAGTTTATGAGAATTCAT
151TTGGGTAAGCATGCTGGTTCTGTTGCTAACTACGATGAAGTTGTTAGATA
201CCCAAAGGAAAAGTTTATTTGTCCAAACAAGAAGAAGAACGTTATTACTG
251ATAAGGATATTATGTTGATTAGATTGGATAGACCAGTTAAGAACTCTGAA
301CATATTGCTCCATTGTCTITGCCATCTAACCCACCATCTGTTGGTTCTGT
351TTGTAGAATTATGGGTTGGGGTGCTATTACTACTTCTGAAGATACTTACC
401CAGATGTTCCACATTGTGCTAACATTAACTTGTTTAACAACACTGTITGT
451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTITT501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTITITGATT ACTTGCCATG651 GATTCAATCT ATTATTGCTG GTAACAAGAC TGCTACTTGT CCA在甲醇酵母菌中實現分泌表達時,可以利用酵母菌的α-信號肽將巴曲酶移出細胞,其中在信號肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入ΚΕΧ2蛋白酶識別序列AAAAGA。本發明對巴曲酶進行定點改造。核酸序列按酵母菌喜好的遺傳密碼子,將編碼第 45位氨基酸的AGA (精氨酸)突變為AAG (賴氨酸),人工合成定點改造的巴曲酶結構基因序列,除定點突變外均為同義突變,即并沒改變氨基酸種類。本發明定點突變的意義就在于,通過定點突變,使巴曲酶分子中的ΚΕΧ2酶切位點 Arg-Arg突變為Arg-Lys,使酵母菌產生的KEX2酶不能對酵母所表達的目的產物巴曲酶進行酶解,從而大大地提高了巴曲酶的產量,并且這種突變并不影響巴曲酶的生物活性。目前,在國內外還未見對巴曲酶進行定點改造的研究報道。將人工合成定點改造的巴曲酶的結構基因重組到酵母菌表達載體pPICZ α中,在酵母菌中實現分泌表達。通過優化發酵條件,確定了酵母菌最優發酵表達條件,并對表達產物進行了分離純化,得到了高活性的重組定點突變巴曲酶。結果表明,定點突變基因工程巴曲酶較從蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。產率達90KU/ml發酵液。比沒有重組突變的巴曲酶的產量提高了近2. 5倍左右。通過對純化工藝的研究,可以采用不同的純化工藝路線,純化得到高純度重組定點突變巴曲酶,經HPLC、電泳檢測純度,達到98. 0%以上。本發明抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,通過制劑處方篩選,制成注射用凍干粉針制劑,并進行了凍干工藝的研究,得到了外觀、活性、含水量等均符合質量標準的注射用粉針制劑,作為抗血栓藥物,可用于治療血管栓塞引起的多種疾病。本凍干制劑具有極好的穩定性。通過60°C高溫影響因素試驗,在同樣溫度下,注射液的酶活性已經下降到原活性的0 對%。而凍干制劑活性只下降到原活性的84 100%,通過結果對比看出,凍干產品具有極高的穩定性。并且經過18個月的長期試驗,其活性基本沒有改變。且該凍干制劑便于運輸和保存,可大幅降低儲運的成本,減少廣大患者的經濟負擔的同時,安全性也得到加強。而目前市場上抗血栓的巴曲酶只有注射液,其儲運必須在低溫條件下才穩定,要求避光、5°C以下保存(但應避免凍結),其嚴格的溫度限制,說明液體制劑對溫度極不穩定,不僅極大地增加了儲運成本,還需要嚴密監視產品的變化,目前的保存期限也只暫定18 個月。此外,在液體制劑中還含有三氯叔丁醇抑菌劑,更加增加了潛在的安全風險。因此,注射用巴曲酶凍干制劑的生產極大地改善了巴曲酶注射液儲運方式,不僅降低了儲運成本, 也降低了由于儲運不當導致的活性損失,更保證了藥品的安全性。另外,本發明凍干制劑還避免了三氯叔丁醇抑菌劑的加入,進一步降低了由此導致的安全隱患。
具體實施例方式實施例1
根據美國Genebank中公開的Bothrops atrox屬,moojeni venom種的巴曲酶 (X12747)的核酸序列(Itoh N, Tanaka N,Mihashi S, Yamashina L,Molecular Cloning and Sequence Analysis of cDNA for Batroxobin, aThrombin—like Snake Venom Enzyme, J Biol Chem. 1987 Mar5 ;262 (7) :3132-5),選擇酵母菌喜好的遺傳密碼子,人工合成巴曲酶的定點改造的結構基因序列,將編碼第45位的Arg的密碼AGA突變為編碼Lys的AAG,將酵母菌內源KEX2蛋白酶識別序列Arg-Arg突變為Arg-Lys,因此KEX2蛋白酶就不會在此位點降解分泌到發酵液中的巴曲酶,從而使目的蛋白能夠大量積累。為使合成的目的基因重組到酵母菌分泌型表達載體pPICZa中,在基因的5'端添加Bio I酶切位點、基因的3'端添加終止密碼子TAATGA及hell酶切位點。另外,在Β ο I酶切位點與巴曲酶蛋白N-端第一個氨基酸Val密碼子之間加入KEX2蛋白酶識別序列Lys-Arg對應的密碼子AAAAGA,這就確保了目的蛋白在分泌到發酵液中時能夠順利地切除α-信號肽。將合成的目的基因及pPICZ α載體經Xho I和SacII雙酶切,電泳、回收,將目的基因重組到pPICZa中,轉化到大腸桿菌ToplOF’中,進行篩選。轉化有pPICZ α的大腸桿菌 ToplOF’在LB+25ug/mg kocin的平板上的進行培養,挑取單菌落,在液體培養基中培養,提取質粒,Xho I和SacII雙酶切檢測或進行α -factor priming禾口 3,A0X1 priming PCR檢測,說明pPICZa中含有目的基因,可以用來轉化Pichia pastoris X-33,KM71H或GS115 宿主菌。實施例2用DNA限制性內切酶McI將pPICZ α -Bg線性化,按照hvitrogen公司 Multi-Copy Pichia Expression Kit Version B中的方法制備酵母宿主感受態并進行轉化,將轉化后的細胞涂在YPD+500ug/ml Zeocin培養基上生長,30°C下放置3_4天可出現單菌落。挑選菌落大而飽滿的克隆進行表達篩選。實施例3用在試管中篩選出的高表達的工程菌,接種到搖瓶中增殖作為種子液,再轉接至 30L發酵罐,按甲醇酵母發酵的常規方法進行中試規模的發酵。誘導200小時以上。當發酵液中蛋白活性不再增加時,將發酵液離心收集上清,蛋白活性達到84KU/ml。經微濾除菌,采用疏水柱層析、離子交換柱層析、凝膠柱層析等生化分離技術,得到純度達97%以上的活性蛋白。采用同類產品活性的測定方法進行體外凝血試驗,具體實驗方法為取人-枸櫞酸抗凝血漿0. anl,加入直徑Icm的試管中,置37°C水浴中保溫3分鐘,加入37°C預熱的樣品溶液0. anl,立即混勻計時,于40秒開始,檢查血漿凝固情況,記錄初凝時間,同時測定3 管,3管初凝時間誤差應小于20秒。若初凝時間小于40秒,則適當稀釋供試品溶液,記錄 60士20秒內凝固的供試品溶液濃度,在上述條件下,能使0. 2ml人-枸櫞酸抗凝血漿在60 秒凝固的酶量,定義為一個KU。實施例4種子液在2L酵母氮源基礎培養基中發酵M小時后,轉到30L發酵液中進行發酵培養。培養基=H3PO4, 27ml/L ;CaSO4 · 2H20,0. 9g/L ;K2SO4 18g/L ;MgSO4 · 7H20,15g/ L ;Κ0Η,4· 13g/L ;甘油 40g/L ;4. 4ml/L 微量礦物質溶液。在發酵過程中,用NH4OH調pH值,使其維持在6. O。30°C通氧劇烈攪拌(IOOOrpm)發酵,添加消泡劑。發酵M小時后,加入含12ml/L微量礦物質的50%甘油,溶氧濃度為 30%,繼續培養10小時。當碳原饑餓30分鐘后,加入甲醇誘導。剛開始的5小時加入甲醇的速率低,不提供氧量,以使酵母適應甲醇,100%甲醇含12ml/L微量礦物質溶液,其溶氧量在30%以上。繼續發酵活性不再增加,凝血活性達到20BU/ml發酵液。實施例5對天然重組巴曲酶進行發酵表達,兩菌種除突變點外,其它遺傳背景完全相同,按照實施例4的發酵條件進行發酵,凝血活性達到^KU/ml發酵液。實施例6發酵液離心,收集上清液,加入(NH4)2SO4使其濃度達至IJ 1.6mol/L,然后加到 phenyl-Sepharose層析柱上,用(NH4)2SO4從1. 6-0mol/L進行梯度洗脫,收集活性峰,然后上親和柱benzamidine-S印haroseCL-6B,50mMTris/HCl,pH 8. 2,洗脫液含0· 5M NaCl,收集活性峰。接著上kphadexG-75,流動相50mMTris/HCl,pH8. 2,含0. 5M NaCl,收集活性峰。 最后,S印hadex G-25脫鹽,收集活性峰。凍干,存于_20°C。SDS-PAGE電泳和HPLC檢測純度達98%以上。送樣品測定氨基酸序列,結果同理論設計的完全一致。見定點突變后的 batroxobin氨基酸序列。實施例7發酵液離心,收集上清液,用65 %固體(NH4) 2S04使活性蛋白鹽析低溫過夜,離心,收集沉淀,溶于50mmol/L Tris-HCl, pH8. 2,并透析,離心,取上清上親和柱 benzamidine-kpharoseCL-4B,用含0. 5mol/L NaCl的上述緩沖液進行洗脫,收集活性峰。 用50mmol/L iTris-HCLpHS. 2緩沖液稀釋,上陰離子交換柱Mono Q,用含0. 5mol/L NaCl上述緩沖液進行洗脫,收集活性峰,最后,上用相同緩沖液平衡好的kphacryl S-200柱,收集活性峰。SDS-PAGE電泳和HPLC檢測純度達98%以上。凍干,存于_20°C。實施例8凍干制劑處方篩選。按照下述配方(如表1所示),配制5BU巴曲酶凍干制劑。在相同條件下真空冷凍干燥樣品,比較凍干前后活力的變化,并進行60°C高溫影響因素試驗 (結果見表2~)。在60°C溫度下放置10天,于第5天和第10天取樣檢測。BU單位定義取人-枸櫞酸抗凝血漿OJml,加入直徑Icm的試管中,置37°C水浴中保溫3分鐘,加入37°C預熱的樣品溶液0. 1ml,立即混勻計時,于19. 2士0. 2秒血漿凝固為 2BU。表1凍干制劑處方
權利要求
1.一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,其特征在于該制劑含有重組定點突變巴曲酶、賦形劑以及凍干保護劑,其比例為,巴曲酶賦形劑保護劑=IOBU 10 IOOmg 0. 1 5mg ;其中重組定點突變巴曲酶的氨基酸序列相對于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的 Arg突變為Lys,具體為1 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEffVLTAA41 HCNRKFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI121 MGffGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCG⑶SGG PLICNGQFQG ILSffGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPffIQS IIAGNKTATC P
2.按照權利要求1所述抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,其特征在于巴曲酶賦形劑保護劑=IOBU 30 70mg 1 4mg。
3.按照權利要求1所述抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,其特征在于,所述重組定點突變巴曲酶,通過將人工合成的定點突變的巴曲酶結構基因在酵母菌中,以分泌表達的方式大量產生獲得。
4.按照權利要求3所述重組定點突變巴曲酶,其特征在于,所述酵母菌為甲醇酵母菌。
5.按照權利要求4所述重組定點突變巴曲酶,其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時,依據巴曲酶的天然氨基酸序列,選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子,人工合成定點突變的巴曲酶結構基因序列。
6.按照權利要求5所述重組定點突變巴曲酶,其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時,將人工合成的定點突變的巴曲酶結構基因插入到甲醇酵母菌表達載體PPICZ α 中。
7.按照權利要求4所述重組定點突變巴曲酶,其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時,利用酵母菌的α-信號肽,將巴曲酶移出細胞,其中在信號肽序列與巴曲酶蛋白序列之間插入ΚΕΧ2蛋白酶識別序列。
8.按照權利要求1所述抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,其特征在于重組定點突變巴曲酶經高密度發酵甲醇誘導表達,親和、離子交換、疏水、凝膠等層析純化,制成凍干制劑。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種抗血栓的重組巴曲酶凍干制劑,其特征在于該制劑含有重組定點突變巴曲酶、賦形劑以及凍干保護劑,其比例為,巴曲酶∶賦形劑∶保護劑=10BU∶10~100mg∶0.1~5mg,優選為巴曲酶∶賦形劑∶保護劑=10BU∶30~70mg∶1~4mg。該凍干制劑活性穩定,安全有效,節約成本,便于運輸和保存。
文檔編號C12N15/81GK102258483SQ20101015778
公開日2011年11月30日 申請日期2010年4月28日 優先權日2010年4月28日
發明者姜大威, 孟威, 徐梅, 楊宇, 段威, 王宏英, 王建華, 薛百忠, 薛雁 申請人:沈陽守正生物技術有限公司
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