一種純化的高比活的重組巴曲酶的制作方法

文檔序號:434047
專利名稱:一種純化的高比活的重組巴曲酶的制作方法
技術領域
本發明涉及遺傳工程領域,尤其涉及純化的高比活的重組巴曲酶及其應用。

背景技術
早在1936年奧地利學者Van Klobusitzky等就從巴西矛頭蛇(Bothrops atrox)的毒液中純化精制出一種酶性止血劑Batroxobin,在國內最早的中譯名稱之為“巴曲酶”。巴曲酶屬于絲氨酸蛋白酶類分子,其分子的生理功能及分子的大小均有類似凝血酶(Thrombin)之處,故稍后也有稱之為“血凝酶”。但隨著對它的深入研究,國內外對巴曲酶在不同的時期賦予了不同的含義。巴西矛頭蛇(Bothrops atrox)有5個亞種,從有的亞種提取的巴曲酶具有止血功效[1],而從另一些亞種中提取的巴曲酶卻具有去除纖維蛋白原的作用,蛇種的差別,導致了習慣上籠稱的“巴曲酶”的蛋白質,事實上在其生物化學本質上是完全不同的有的是止血功效為主,有的則是降纖作用為主,至于這種化學本質上的不同是源于氨基酸序列上的差別或是由于糖基等蛋白質修飾上的差別還有待進一步研究考察。
目前只有從蛇毒中提取制備的巴曲酶用于治療多種臨床適應癥(如,心肌梗死、老年癡呆、中風、突發性耳聾等等)的專利(US Pat.No5595974,5869044,6106830,6399576,6416717;Eur.Pat.No0984279,0826374,0750912,0719791)和研究報告,還沒有重組巴曲酶用于動物試驗和臨床研究工作的任何相關研究報導。從蛇毒中生物提取的巴曲酶主要來自巴西矛頭蛇(Bothropsmoojeni,Bothrops atrox)的毒液中,含量很低,其原料的獲得以及天然巴曲酶純品的獲得難度大,往往還會在終產品中殘留少量蛇的毒素以及許多不明雜質,給臨床使用帶來潛在的風險。高度純化后的天然巴曲酶的理論分子量應該也是25.6kDa,但實際上該蛋白在毒蛇的毒腺細胞中分泌表達是發生了糖基化修飾,實際分子量37-43kDa,這種分子量有一范圍的原因或是糖基化修飾程度上有差別,也有純化手段不同而導致的糖鏈丟失等原因所引起。從蛇毒中提取制備的天然巴曲酶,由于蛇毒原料的來源受養蛇的規模、四季節變化等因素影響,其質量控制是很困難,產品的比活性也很不穩定。
對巴曲酶這種來自蛇毒的蛋白質分子生物學研究一直進展緩慢,直到1987、1988年才由日本的研究者完成對巴曲酶基因的cDNA和基因組DNA測序工作。1991年日本藤澤制藥公司(Fujisawa Pharmaceutical)的研究者采用基因重組方法,在E.coli中,采用融合表達系統,以包涵體(InclusionBody)的形式表達出該成分,再通過制備電泳和凝血酶切割開融合蛋白的方法得到所謂有生物學活性巴曲酶,而且還為此申請了專利(Pat.No.JP2124092,1990)。采用基因工程的手段生產富含二硫鍵的蛋白一直都是一個技術難題,尤其是生產有多對二硫鍵的絲氨酸蛋白水解酶類分子。這是因為二硫鍵配對錯誤率很高,在原核中得到的幾乎全是包涵體,雖然日本藤澤制藥公司報道了通過對包涵體的變性-復性能得到有活性的目的蛋白,但是其比活低,重現性差,直到現在也未見該公司有重組巴曲酶產品問世。
因此,本領域迫切需要一種不受季節限制,生產規模容易控制的重組的巴曲酶產品,它具有極高的二硫鍵配對正確率,而且活性高。


發明內容
本發明的第一目的是提供一種基因重組的巴曲酶。
本發明的第二個目的是提供所述基因重組的巴曲酶的用途。
本發明的第三個目的是提供含有所述基因重組的巴曲酶的藥物組合物。
在本發明的第一方面,提供了一種純化的重組巴曲酶,所述的巴曲酶具有以下特性 (a)分子量為29-32kDa; (b)所述重組巴曲酶中至少90%(≥90%)巴曲酶具有正確的6對二硫鍵配對Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199; (c)在SEQ IDNO1中第146位和第225位被N-型糖基化修飾;和 (d)所述巴曲酶的比活性大于等于1500KU/mg蛋白。
在另一優選例中,所述重組巴曲酶中至少95%具有正確的6對二硫鍵配對。
在另一優選例中,所述巴曲酶中的糖基化是在以下位點Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228中的Asn氨基酸殘基中發生N-糖基化修飾。
在另一優選例中,其N-型糖基化修飾可使巴曲酶蛋白的分子量在25.6kDa的基礎上增加4000-6000kDa。
在另一優選例中,所述巴曲酶的比活性1500-3000KU/mg。
在另一優選例中,所述巴曲酶中至少99%具有正確的6對二硫鍵配對。
在本發明的第二方面,提供了上述純化的重組的巴曲酶在制備止血藥物中的應用。
在本發明的第三方面,提供了一種藥物組合物,它含有上述的重組巴曲酶和藥學上可接受的載體。
在另一優選例中,所述的組合物還含有水解明膠作為穩定劑。
在另一優選例中,所述的組合物為液體或凍干粉的形式。
據此,本發明提供了一種不受季節限制,生產規模容易控制的重組的巴曲酶產品,它具有極高的二硫鍵配對正確率,而且活性高。



圖1顯示了本發明提供的基因重組巴曲酶的C-端序列及在Asn225位上有糖基化修飾。
圖2顯示了本發明提供的基因重組巴曲酶的Asn146位上有糖基化修飾。
圖3中A顯示了非還原的胰凝乳蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak圖譜;B顯示了還原的胰凝乳蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak圖譜。
圖4中A顯示了非還原的胰蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak圖譜;B顯示了還原的胰蛋白酶和F1酶解的rBAT的Base Peak圖譜。
圖5中A顯示了非還原的胰凝乳蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak圖譜;B顯示了還原的胰凝乳蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak圖譜。
圖6中A顯示了非還原的胰蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak圖譜;B顯示了還原的胰蛋白酶和N-糖苷酶F酶解的rBAT的Base Peak圖譜。
圖7A-7D顯示了二硫鍵C7-C139的檢測圖譜;其中 7A是包含二硫鍵C7-C139的肽段的質荷比m/z圖譜; 7B是包含二硫鍵C7-C139的肽段的MS/MS圖譜; 7C是包含半胱氨酸C7的MS/MS圖譜; 7D是包含半胱氨酸C139的MS/MS圖譜。
圖8A-8B顯示了二硫鍵C26-C42的檢測圖譜;其中 8A是包含二硫鍵C7-C139的肽段的質荷比m/z圖譜; 8B是包含半胱氨酸C26和C42的MS/MS圖譜。
圖9A-9D顯示了二硫鍵C74-C230的檢測圖譜;其中 9A是包含二硫鍵C74-C230的肽段的質荷比m/z圖譜; 9B是包含二硫鍵C74-C230的肽段的MS/MS圖譜; 9C是包含半胱氨酸C74的MS/MS圖譜; 9D是包含半胱氨酸C230的MS/MS圖譜。
圖10A-10C顯示了二硫鍵C118-C184的檢測圖譜;其中 10A是包含二硫鍵C118-C184的肽段的質荷比m/z圖譜; 10B是包含二硫鍵C118-C184的肽段的MS/MS圖譜; 10C是包含半胱氨酸C118的MS/MS圖譜。
圖11A-11C顯示了二硫鍵C150-C1163的檢測圖譜;其中 11A是包含二硫鍵C150-C163的肽段的質荷比m/z圖譜; 11B是包含二硫鍵C150-C163的肽段的MS/MS圖譜; 11C是包含半胱氨酸C150的MS/MS圖譜。
圖12A-12D顯示了二硫鍵C174-C199的檢測圖譜;其中 12A是包含二硫鍵C174-C199的肽段的質荷比m/z圖譜, 12B是包含二硫鍵C174-C199的肽段的MS/MS圖譜; 12C是包含半胱氨酸C174的MS/MS圖譜; 12D是包含半胱氨酸C199的MS/MS圖譜。
圖13顯示了發酵液、超濾液非還原電泳圖譜;其中泳道1表示蛋白標記物(Marker),2表示超濾前發酵上清液,3表示超濾流出液,4表示超濾后發酵上清液。
圖14顯示了陽離子交換層析后的洗脫圖譜和電泳圖譜(非還原SDS-PAGE);其中泳道1表示蛋白標記物(Marker),2表示超濾后發酵上清,3表示陽離子交換流出液,4表示20mM NaAc-HAc+0.15MNaCl洗脫液,5表示20mM NaAc-HAc+0.50MNaCl洗脫液,6表示20mM NaAc-HAc+1.0MNaCl洗脫液。
圖15顯示了陰離子交換層析后的洗脫圖譜和電泳圖譜(非還原SDS-PAGE);其中泳道1表示蛋白標記物(Marker),2表示陽離子交換目的蛋白洗脫液,3表示陰離子交換上樣流出液,4表示20mM Tris-HCl+0.15MNaCl洗脫液,5表示20mM Tris-HCl+0.50MNaCl洗脫液。
圖16顯示了凝膠過濾層析后的洗脫圖譜和電泳圖譜;其中泳道1表示蛋白標記物(Marker),2表示超濾后發酵上清,3表示陽離子交換rBAT洗脫液,4表示陰離子交換rBAT洗脫液,5-7表示rBAT原液。
圖17顯示了巴曲酶的氨基酸序列(SEQ ID NO1),其中糖基化位點用下劃線表示。

具體實施例方式 發明人經過廣泛而深入的研究,通過改進巴曲酶的表達和純化工藝,從而制得了一種高比活的重組巴曲酶。它具有以下特性 (a)分子量為30-32Kda; (b)所述重組巴曲酶中至少90%巴曲酶具有正確的6對二硫鍵配對Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199; (c)在SEQ ID NO1中第146位和第225位被糖基化;和 (d)所述巴曲酶的比活性大于1500KU/mg蛋白。
在甲醇酵母(Pichia pastoris)中成功實現了分泌表達有生物學活性的巴西矛頭蛇(Bothropsatrox)巴曲酶后,經多步層析純化得到純度不低于95%的巴曲酶純品。
如本文所用,1KU是取0.1ml的人標準血漿于標準血凝儀(C2000-4血凝儀,北京普利生儀器有限公司)檢測杯中,37℃預溫3分鐘,加入經適量稀釋的待測定的巴曲酶溶液0.1ml,計時,如果血漿在60±20秒凝固,則每1ml該待測溶液中就含一個克氏單位(KU)的巴曲酶。
本發明提供的基因重組巴曲酶是由231個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白(SEQ ID NO1),分子量為29-32Kda,它有兩個N-糖基化位點Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。
本發明提供的基因重組巴曲酶中至少90%具有正確的6對二硫鍵配對,它的二硫鍵連接方式為Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys163和Cys174-Cys199。較佳地≥95%,更佳地≥98%巴曲酶具有正確的二硫鍵配對。
本發明提供的基因重組巴曲酶的比活性大于等于1500KU/mg蛋白,較佳地為1500-2000KU/mg,更佳地為1500-3000KU/mg。
本發明提供的基因重組巴曲酶利用甲醇酵母喜好的密碼子,人工合成了巴曲酶基因序列,構建表達載體,最終在甲醇酵母(Pichia pastoris)中獲得了分泌表達有生物學活性的巴西矛頭蛇(Bothrops atrox)巴曲酶。發明人發現真核細胞表達系統(酵母、CHO和昆蟲細胞等)中能保證較高二硫鍵配對正確率和表達蛋白的后修飾。發明人在甲醇酵母(Pichia pastoris,Pichia methanolica)中成功地表達出了有生物學活性的巴曲酶蛋白,產量能達到每毫升發酵液20克氏單位(20KU/ml),這一產量具備開發的意義。
發酵上清經過分離純化可獲得純化的重組巴曲酶。在本發明的一個優選例中,所述的純化步驟包括超濾、陽離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠層析,通過優化的層析條件,得到二硫鍵配對正確率高、比活性強的重組巴曲酶高純品。
本發明得到的發酵上清中含有大量的雜蛋白、無機鹽、色素等等,因此,本發明先采用超濾的方法脫鹽除雜蛋白及更換緩沖液,以利于后面的離子交換層析操作。本發明進行超濾的條件為進口壓力5-10psi,出口壓力2-5psi,流速100-200ml/min。超濾平衡緩沖液pH4-6,較佳地pH4.5-5.5。所述的超濾平衡緩沖體系中可以是本領域常用的鹽類,例如但不限于醋酸鈉鹽、磷酸鈉鹽、檸檬酸鈉鹽、Tris-HCl,其中優選醋酸鈉-醋酸和氯化鈉。所得到的超濾液電導值為8mS/cm以下,較佳地電導值為5mS/cm以下,更佳地電導值為4mS/cm以下。
然后,本發明對超濾后的發酵上清進行陽離子交換層析??梢允褂帽绢I域常用的陽離子交換層析柱,例如但不限于SP SepheroseFF,CM SepheroseFF,,優選SP SepheroseFF。洗脫緩沖液pH4-6,較佳地pH4.5-5.5;可以是本領域常用的鹽類,例如但不限于醋酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉、其中優選醋酸鈉-醋酸和氯化鈉。其中氯化鈉的濃度為0.1-1.0M,較佳地為0.15-1.0M,更佳地為0.4-0.6M。一種優選的洗脫方式是梯度洗脫。
第三步,是將經陽離子交換層析柱后的洗脫液進行陰離子交換層析??梢允褂帽绢I域常用的陰離子交換層析柱,例如但不限于Q Sepherose,DEAE Sepherose,Source 30Q,優選Q SepheroseFF。洗脫緩沖液pH7.5-10,較佳地pH8.5-9.5;可以是本領域常用的鹽類,例如但不限于Tris-鹽酸、磷酸鈉、氯化鈉,其中優選Tris-HCl和氯化鈉。其中氯化鈉的濃度為0.05-1.0M,較佳地為0.10-0.6M,更佳地為0.15-0.5M。一種優選的洗脫方式是梯度洗脫。
最后,將經經陰離子交換層析柱后的洗脫液進行凝膠過濾層析??梢允褂帽绢I域常用的凝膠過濾層析柱,例如但不限于Sephacryl S,Sepharose4,SephadexG-25,Superdex,優選Superdex75。洗脫緩沖液pH4-6,較佳地pH4.5-5.5;可以是本領域常用的鹽類,例如但不限于醋酸鈉、磷酸鈉、氯化鈉,其中優選醋酸鈉-醋酸和氯化鈉。其中氯化鈉的濃度為0.05-0.5M,較佳地為0.10-0.3M,更佳地為0.12-0.2M。
經過上述步驟,得到本發明提供的純化的基因重組巴曲酶。也可以使用本領域熟知的基因工程方法得到含有巴曲酶蛋白的發酵液,然后經過上述的純化步驟獲得本發明提供的基因重組巴曲酶。
本發明提供的基因重組巴曲酶可用于止血。巴曲酶的特異性作用底物是纖維蛋白原,與凝血酶不同的是,它只切割纖維蛋白原的A鏈,而不作用B鏈。當它水解血漿纖維蛋白原A鏈中的Arg16-Gly17位肽鍵時,能夠釋放出纖維蛋白肽A,從而快速地將血液中的纖維蛋白原轉變成纖維蛋白,接著這些纖維蛋白就能聚集成疏松的易于被纖維蛋白酶水解的血栓來封閉傷口,實現快速止血的功效。不過,在使用較大劑量的時侯,巴曲酶能降低血中纖維蛋白原濃度,改善血液黏度和血液的流體力學特性,從而起到降纖酶的功效(US Pat.No3849252,1974)。
本發明還提供一種藥物組合物,它含有本發明提供的純化的基因重組巴曲酶和藥學上可接受的載體。
本發明提供的藥物組合物中還可以含有水解明膠作為穩定劑。本發明提供的藥物組合物可以是固態形式或液體形式,其中優選液體形式,更優選注射液。
本發明的主要優點在于 1、本發明提供的基因重組巴曲酶二硫鍵配對正確率極高。
2、本發明提供的基因重組巴曲酶比活性很高。
3、本發明提供了獲得上述優質基因重組巴曲酶的分離純化方法。
下面將結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則所有的百分比和份數按重量計。
實施例1 制備實施例 一、獲得含巴曲酶蛋白的發酵液 rBAT工程菌在30L罐中的發酵 按1∶10的接種比例接入已預先滅菌裝有15L分批發酵培養基的30L發酵罐中,進行分批補料培養(用氨水將pH控制在4.0,溫度控制在30℃),當碳源耗盡后(DO陡然上升,1分鐘內),流加甘油(流加速率維持溶氧大于20%)。當菌體濕重為200克/L左右停止補料,甘油耗盡后,補入甲醇誘導表達(pH用氨水控制為5.8,溫度控制在20℃),通過調節轉速、罐壓、空氣流量和補料速率使溶氧大于20%,誘導時間為60小時。發酵結束,4000rpm離心收集發酵上清,測定活性確認表達產量應該不低于20KU/ml。將發酵上請凍存或直接進入純化過程。
二、分離純化 第一步超濾更換緩沖液。選用Millipore Pellicon 10K超濾膜堆,Millipore Masterflex蠕動泵,超濾器進口壓力、出口壓力分別控制為6psi、3psi,流速為120ml/min,超濾膜先后用注射用水、緩沖液20mM NaAc-HAc+0.15M NaCl(pH5.0)平衡好后,對發酵上清液進行超濾。當超濾至原來體積的五分之一時,補加緩沖液20mM NaAc-HAc(pH5.0)至原來體積,如此反復操作三次,最后補加緩沖液20mM NaAc-HAc(pH5.0)至原來體積作為陽離子交換層析上樣液。
第二步陽離子交換層析填料SP Sepharose F F。平衡緩沖液為20mM NaAc-HAc(pH5.0),洗脫緩沖液分別為20mMNaAc-HAc+0.15MNaCl(pH5.0)、20mMNaAc-HAc+0.50MNaCl(pH5.0)、20mM NaAc-HAc+1.0M NaCl(pH5.0),收集20mM NaAc-HAc+0.50M NaCl(pH5.0)洗脫液。
第三步陰離子交換層析Q SepharoseFF。將陽離子交換20mMNaAc-HAc+0.50M NaCl(pH5.0)洗脫液調節pH值至9.0,稀釋電導至3.0mS/cm上樣,平衡緩沖液為20mM Tris-HCl(pH9.0),洗脫緩沖液分別為20mM Tris-HCl+0.15M NaCl(pH9.0),20mM Tris-HCl+0.50M NaCl(pH9.0),收集20mM Tris-HCl+0.15M NaCl(pH9.0)洗脫液。
第四步凝膠過濾層析Superdex75填料,6.0×60cm預裝柱,CV1700ml。緩沖液采用20mMNaAc-HAc+0.15M NaCl(pH5.0),將陰離子交換層析20mM Tris-HCl+0.15M NaCl(pH9.0)洗脫液分批次上樣,分段收集rBAT主峰,將純度大于95%的樣品合并,除菌后即為rBAT原液I。
實施例2 性能實施例 對實施例1制得的rBAT原液I進行檢測 1.實驗主要參數 檢測儀器型號LCQ DECA XP plus 進樣方式Microspray 毛細管溫度170℃ 色譜柱0.15MM*150MM(RP-C18) 儀器公司FINNIGAN檢測方式正離子 2.實驗方法 樣品rBAT超濾除鹽,碘乙酰胺(IAA)修飾→胰蛋白酶(Trypsin)和胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)酶解→N-糖苷酶F和F1酶解→1/2酶解產物二硫蘇糖醇(DTT)還原、IAA修飾→質譜分析→數據分析,確定rBAT蛋白質的C端序列,糖基化位點和二硫鍵配對方式。
3.實驗結果及分析 3.1C端序列分析 蛋白C-端序列質譜法鑒定的原理先用蛋白酶對待測蛋白進行酶解,得到含有C端序列的肽段,然后通過比較實驗得到的二級質譜和理論得到的二級質譜的相似性(Xcorr),從而對C-端序列進行驗證。
如果沒有用N-糖苷酶(PNGase F)對rBAT蛋白進行脫糖處理,則不能確認rBAT蛋白質的C-端序列。然而,當用N-糖苷酶(PNGase F)對rBAT蛋白酶解產物進行脫糖處理后,實驗數據和理論得到的二級質譜符合得很好,其C-端序列可驗證為IQSIIAGDKTATCP。注意,PNGase F在脫除連接在Asn上的糖鏈的同時,也將Asn轉變為Asp,同時,Cys也被修飾,變成為乙?;陌腚装彼?。實驗結果如圖1所示。實驗中觀察到一系列的b和y離子,如b2,b3,b5-b12,y1-y4,y6,y8-y12。b和y是實驗中最常見的碎片離子,是因為肽段的肽鏈的斷裂而產生的。如果斷裂后的電荷在肽段的N端,則是b離子,如果電荷在肽段的C端,則是y離子。如該圖中的y1-8離子,其是GDKTATCP+,y表示該離子是y系列離子,1表示該離子帶的電荷數是1,而8則說明肽鍵斷裂的位置。
3.2糖基化位點的確定 糖基化為點鑒定原理先用蛋白酶對待測蛋白進行酶解,得到不同大小的肽段。然后,部分酶解后的樣品用PNGase F切除連接在Asn上的糖鏈,并將Asn轉變為Asp。然后對經過脫糖處理和未經過脫糖處理的樣品分別進行HPLC-MS-MS分析。通過比較實驗得到的肽段覆蓋率,可以鑒定出是否有糖基化修飾以及糖基化修飾的位點。
實驗發現兩個N-糖基化位點,一個為Asn146,另一個為Asn225。Asn225糖基化位點的鑒定見圖1。Asn146糖基化位點的鑒定見圖2。
注意N-糖苷酶將N-糖鏈切除后,同時將Asn轉變為Asp,同時,cys也被修飾,變成為乙?;陌腚装彼?。絕大部分的b和y離子都被檢測到,如b1-b8,y1-8,這充分證實了該肽段的序列。
3.3二硫鍵配對方式 質譜法鑒定二硫鍵的原理首先用碘乙酰胺(IAA)將待測蛋白的游離的半胱氨酸封閉起來,然后用蛋白酶在非還原狀態下對待測蛋白進行酶解。一部分酶解產物直接進行HPLC-MS-MS分析,另一部分則用二硫蘇糖醇(DTT)還原,然后用碘乙酰胺對半胱氨酸進行修飾,防止形成新的二硫鍵。最后,通過比較所檢測到的肽段的差異,得出由DTT還原而產生的新的肽段,從而推斷出二硫鍵的連接方式。最后,從非還原狀態下酶解產物的二級質譜圖中,通過對比母離子的分子量和二級質譜圖,從而確認二硫鍵的連接方式。
因為在rBAT蛋白中存在糖基化修飾,而從上面的數據中發現,在糖基化修飾位點有半胱氨酸的存在,這會影響到二硫鍵配對方式的檢出,因此,在蛋白酶酶解后,我們加入了用PNGaseF除去糖鏈的步驟,這樣為二硫鍵配對方式的檢出提供了便利條件。我們設計了rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-非還原和rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-還原、rBAT-胰蛋白酶-N-糖苷酶F-非還原和rBAT-胰蛋白酶-N-糖苷酶F-還原、rBAT-胰凝乳蛋白酶-F1-非還原和rBAT-胰凝乳蛋白酶-F1-還原、rBAT-胰蛋白酶-F1-非還原和rBAT-胰蛋白酶-F1-還原四組對照實驗。從這四組數據中,我們分析了75種可能的包含二硫鍵的肽段,共47種二硫鍵配對方式。應用嚴格的篩選標準,六對二硫鍵被檢測到C7-C139、C26-C42、C74-C230、C118-C184、C150-C163和C174-C199;另外微量的沒有形成二硫鍵的半胱氨酸肽段C7、C118和C150也被檢測到。具體結果見實驗圖譜3-6和圖8-12。
對通過二硫鍵結合的肽段,由于其包含兩段肽鏈,其斷裂的方式比較多。其可能是其中的某一個鏈斷裂,而通過二硫鍵結合的另外一個肽鏈則保持不變。也有可能是兩個肽鏈分別斷裂。在此,以通過Cys7和Cys139連接的肽段為例,說明二硫鍵連接方式的判定方法。在rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-非還原和rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-還原的實驗中,我們檢測到VIGGDECDINEHPF和GAITTSEDTYPDVPHCANIN這兩個肽段(圖7C和圖7D),而這兩個肽段的在rBAT-胰凝乳蛋白酶-N-糖苷酶F-非還原實驗中沒有被檢測到。在非還原樣品中,我們檢測到荷質比為916.1Da,1221.3Da和1831.4Da的峰(如圖7A),通過去卷積分析,發現這三個峰都對應于分子量為3660.3的肽段,他們分別是該肽段的四價,三價和二價離子。而由VIGGDECDINEHPF和GAITTSEDTYPDVPHCANIN通過二硫鍵連接的肽段的分子量剛好是3660.9Da.。由此,可以推斷出這兩段肽是通過二硫鍵結合的。進一步的二級質譜數據證實了這種推斷。圖7B是通過二硫鍵連接的VIGGDECDINEHPF和GAITTSEDTYPDVPHCANIN的二級質譜。實驗中,檢測到一系列的C139-y2離子(Cys139-y2-5到Cys139-y2-18)。這充分證實了其二硫鍵的存在。以Cys139-y2-10為例,其檢測到的荷質比為1311.33Da。C139表示該離子是通過含有Cys139殘基的肽鏈的斷裂而產生的,另外一個肽鏈則依然通過二硫鍵連接在上面;y2說明該離子是y系列的離子,并且帶有2個電荷;10則表示肽鍵斷裂的位置(Y-P)鍵。
結果表明,所制得的rBAT原液I中的rBAT二硫鍵配對正確率為≥95%。
3.4通過發酵層析純化后獲得的rBAT蛋白原液I 純度98% 濃度1.02mg/ml 比活性2000KU/mg 實施例3 純化工藝研究實施例 1.疏水層析條件的研究 由于發酵采用無機鹽培養基(pH值6.0左右),所以發酵上清含有較高的鹽,電導較高,故想采用疏水層析作為純化第一步,粗純rBAT。
1.1pH6.0時疏水層析條件的研究 分別取發酵上清100ml,按如下操作 上述A、B、C組,調節pH值至6.0后,12000rpm、室溫、離心10分鐘,收集上清,分別測定活性。
選用Phenyl Sepharose FastFlow 1ml預裝柱,經緩沖液120mM PB,1.5M(NH4)2SO4,pH6.0平衡后,上A組(上樣體積100ml,以下同),收集流出液,測定活性;Phenyl SepharoseFastFlow1ml預裝柱再生后,經緩沖液220mMPB,1.0M(NH4)2SO4,pH6.0平衡后,上B組,收集流出液,測定活性;Phenyl Sepharose FastFlow 1ml預裝柱再生后,經緩沖液320mM PB,0.5M(NH4)2SO4pH6.0平衡后,上C組,收集流出液,測定活性。結果如下表 由上表數據可見,在此條件下rBAT與Phenyl Sepharose Fast Flow結合不好,有相當一部分流出,所以此種條件不適于rBAT的純化。
1.2pH5.0時疏水層析條件的研究 分別取發酵上清100ml,按如下操作 上述D、E、F組,調節pH值至5.0后,12000rpm、室溫、離心10分鐘,收集上清,分別測定活性。
選用Phenyl Sepharose FastFlow 1ml預裝柱,經緩沖液420mM NaAc-HAc,1.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上D組(上樣體積100ml,以下同),收集流出液,測定活性;PhenylSepharose FastFlow 1ml預裝柱再生后,經緩沖液520mM NaAc-HAc,1.0M NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上E組,收集流出液,測定活性;Phenyl Sepharose FastFlow 1ml預裝柱再生后,經緩沖液620mM NaAc-HAc,0.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上F組,收集流出液,測定活性。結果如下表 pH降低以后,rBAT蛋白的疏水性有所增加,與pH6.0時相比,流出液的活性無多大變化,仍有相當部分的流出,所以應當更換疏水填料作進一步的研究。
1.3pH5.0時,Butyl與Octyl填料的研究 分別取發酵上清100ml,按如下操作 上述G、H組,調節pH值至5.0后,12000rpm、室溫、離心10分鐘,收集上清,分別測定活性。
選用Butyl Sepharose FastFlow 1ml預裝柱,經緩沖液720mM NaAc-HAc,1.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上G組(上樣體積100ml,以下同),收集流出液,測定活性;選用Octyl Sepharose FastFlow 1ml預裝柱,經緩沖液820mM NaAc-HAc,1.5M(NH4)2SO4,pH5.0平衡后,上H組,收集流出液,測定活性。結果如下表 在此條件下,rBAT與填料的結合沒有改善,流出液中rBAT的比例仍很高。
綜上所述,由于rBAT與疏水填料的結合性能不好,即使降低了整個操作系統的pH值,提高的效果不大,且以上操作均在室溫下進行,若再增加操作時的溫度以提高疏水性,對rBAT蛋白的活性可能會有影響,所以這提示疏水層析并不適合rBAT蛋白的純化。
2.陽離子交換層析條件的研究 由于發酵上清中含有大量的雜蛋白、無機鹽、色素等等,擬采用超濾的方法脫鹽除雜蛋白及更換緩沖液,以利于后面的離子交換層析操作。但由于不清楚rBAT蛋白采用哪種緩沖液適合離子交換層析,即不清楚超濾時更換哪種緩沖液,所以應該首先研究rBAT蛋白在不同條件下的離子交換層析的吸附行為,以確定緩沖液,再來研究超濾的條件。
2.1上樣液最佳pH及電導的優選 根據rBAT的等電點(理論等電點為7.39),把發酵上清液,用1M的HAc分別調節pH值為4.5、5.0、5.5和6.0。在各個pH值下,用注射用水分別把發酵上清稀釋至電導如下表所示。選用1ml SP Sepharose Fast Flow預裝柱,上樣量為50ml發酵上清(稀釋前),流速為1.0ml/min,收集流出液并測定活性,進行上樣液條件優選,結果如下 pH=4.5,平衡緩沖液20mM NaAc-HAc,pH4.5 pH=5.0,平衡緩沖液20mM NaAc-HAc,pH5.0 pH=5.5,平衡緩沖液20mM NaAc-HAc,pH5.5 pH=6.0,平衡緩沖液20mM NaAc-HAc,pH6.0 由以上表中的各數據可知,在pH=4.5與5.0的條件下,稀釋液的電導為4.0mS/cm時,rBAT基本上沒有流出,考慮到pH值對rBAT蛋白活性的影響,故選用把發酵上清調節pH值至5.0,稀釋電導至4.0mS/cm,平衡緩沖液為20mM NaAc-HAc,pH5.0的條件,來研究rBAT蛋白在陽離子交換層析上的洗脫行為。所以,超濾更換的緩沖液為20mM NaAc-HAc,pH5.0,且應超濾至電導4.0mS/cm以下。
2.2超濾條件的研究 采用Millipore Pellicon 10K超濾器、Millipiore Masterflex蠕動泵,操作參數進口壓力10psi,出口壓力5psi,流速200ml/min。先后用注射用水、緩沖液20mM NaAc-HAc,pH5.0將超濾器平衡好,然后取5L發酵液開始超濾,至剩余1L發酵液時,補加緩沖液20mM NaAc-HAc,pH5.0至5L,如此反復循環3次,最后用緩沖液20mMNaAc-HAc,pH5.0補足至5L(經測定pH5.0,電導3.5mS/cm),分別取發酵液、超濾液、流出液測定活性,結果如下 此條件下超濾的損失在20%左右,疑為膜堆非特異性的吸附或操作壓力過大所致,所以做第二次試驗時,先用注射水將進口壓力、出口壓力分別調整為6psi、3psi,流速調整為120ml/min,用緩沖液20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0平衡超濾系統。取5L發酵液開始超濾,至剩余1L發酵液時,補加緩沖液20mM NaAc-HAc,pH5.0至5L,如此反復循環3次,最后用緩沖液20mMNaAc-HAc,pH5.0補足至5L(經測定pH5.0,電導3.5mS/cm),分別取發酵液、超濾液、流出液測定活性,結果如下 結果表明,通過超濾更換緩沖液,rBAT的活性得率在90%上。超濾后的發酵上清非常有利于下一步的陽離子交換層析。
2.3陽離子交換層析洗脫條件的研究 選用1ml SP Sepharose F F預裝柱,平衡緩沖液A20mM NaAc-HAc,pH5.0,洗脫緩沖液為B20mM NaAc-Hac,1.0M NaCl,pH5.0,把50ml超濾后發酵上清液以1.0ml/min的流速上樣,上樣完畢后用平衡緩沖液A平衡,進行梯度洗脫,條件為0-100%B,20CV,流速1.0ml/min,結果發現在0-100%B的洗脫過程中共含有三個洗脫峰,出峰位置分別位于18%B、45%B和60%B處,分別取樣測活;最后用2M NaCl再生柱子,收集再生峰并測活。所有結果如下 由上表數據可知,rBAT蛋白主要集中在45%B(0.45MNaCl)洗脫峰內,但在18%B(0.18MNaCl)洗脫峰的中后段、60%B(0.60MNaCl)洗脫峰的中前段也有少量的rBAT蛋白,所以應把18%B適當降低、45%B適當升高,使得rBAT蛋白主要集中在一個洗脫峰內。因此重復以上試驗過程,只是在洗脫時采用15%B、50%B和100%B分段洗脫,分別收集各洗脫峰,測定活性,結果如下 由上表的數據可知,rBAT蛋白絕大部分集中在50%B(0.50M NaCl)洗脫峰內,15%B(0.15MNaCl)洗脫峰的后段和100%B(1.0M NaCl)洗脫峰的前段雖有少量的rBAT蛋白,但相對于發酵液來講,活性已經很低,所以最后把洗脫條件確定為20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0、20mMNaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0和20mM NaAc-HAc,1.0M NaCl,pH5.0,收集20mM NaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脫峰,即為rBAT蛋白峰。
2.4陽離子交換層析過程的分析研究 選用規格為1.6×15cm的層析柱,內裝20ml SP Sephrose FF填料,上樣流速為10ml/min,把1000ml超濾后發酵上清液上樣。平衡緩沖液為20mM NaAc-HAc,pH5.0,洗脫緩沖液分別為20mMNaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0、20mM NaAc-HAc,0.50M NaCl,pH5.0,和20mM NaAc-HAc,1.0MNaCl,pH5.0,分別收集各個洗脫峰(1.0M洗脫峰色素較重),洗脫圖譜和電泳圖譜(非還原SDS-PAGE)如圖14 對各個收集液分別取樣,測定活性,結果如下 結果表明,20mM NaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脫峰,為rBAT蛋白峰。
3.陰離子交換層析條件的研究 3.1上樣液最佳pH及電導的優選 根據rBAT的等電點(理論等電點為7.39),把上步20mMNaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脫峰,用1M的NaoH分別調節pH值為8.0、8.5、和9.0。在各個pH值下,用注射用水分別稀釋至電導如下表所示。選用1ml Q Sepharose Fast Flow預裝柱,上樣量為10ml陽離子交換rBAT收集液(稀釋前),流速為1.0ml/min,收集流出液并測定活性,進行上樣液條件優選,結果如下 pH=8.0,平衡緩沖液20mM Tris-HCl,pH8.0 pH=8.5,平衡緩沖液20mM Tris-HCl,pH8.5 pH=9.0,平衡緩沖液20mM Tris-HCl,pH9.0 由以上表中的各數據可知,在pH9.0條件下,稀釋液的電導為3.0mS/cm時,rBAT基本上沒有流出,故選用把陽離子交換rBAT收集液調節pH值至9.0,稀釋電導至3.0mS/cm,平衡緩沖液為20mM Tris-HCl,pH9.0,來研究rBAT蛋白在陰離子交換層析上的洗脫條件。
3.2陰離子交換層析洗脫條件的研究 選用1ml Q Sepharose F F預裝柱,平衡緩沖液A為20mM Tris-HCl,pH9.0,洗脫緩沖液B為20mM Tris-HCl,1.0M NaCl,pH9.0,把10ml陽離子交換rBAT收集液調節pH值至9.0,稀釋電導至3.0mS/cm,1.0ml/min的流速上樣。首先進行梯度洗脫,條件為0-100%B,20CV,流速1.0ml/min,結果發現在0-100%B的洗脫過程中共含有兩個洗脫峰,出峰位置分別位于10%B和50%B處,但是10%B峰拖尾比較嚴重,分別收集并取樣測活;最后用2MNaCL再生柱子,收集再生峰并測活。結果如下 為了克服10%B洗拖峰的拖尾問題,洗脫條件改為從0-40%B,5CV,后升至50%B,流速1.0ml/min,第一峰的拖尾有明顯改善,峰尖位于15%B處,分別收集并取樣測定活性。結果如下 所以最后把洗脫條件確定為20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0、20mM Tris-HCl,0.50MNaCl,pH9.0,收集20mMTris-HCl,0.15MNaCl,pH9.0洗脫蛋白峰,即為rBAT蛋白峰。
3.3陰離子交換層析過程的分析研究 選用規格為1.6×15cm的層析柱,內裝20ml Q Sephrose F F填料,上樣流速為10ml/min,把200ml陽離子交換rBAT收集液調節pH值至9.0,稀釋電導至3.0mS/cm上樣。平衡緩沖液為20mMTris-HCl,pH9.0,洗脫緩沖液分別為20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0和20mM Tris-HCl,0.50MNaCl,pH9.0,分別收集各個洗脫峰,洗脫圖譜和電泳圖譜(非還原SDS-PAGE)如圖15 對各個收集液分別取樣,測定活性。結果如下 由此可見20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0洗脫峰,即為rBAT蛋白峰。
4.凝膠過濾層析的條件 選用Pharmacia公司Superdex 75填料,6.0×60cm預裝柱,CV1700ml,平衡緩沖液為20mMNaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0,將陰離子交換層析20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0洗脫液分批次上樣,每次上樣量不超過85ml(柱體積的5%),分段收集洗脫峰,將純度大于95%的樣品合并,除菌后即為rBAT原液。
洗脫圖譜及電泳圖譜如圖16 5.純化工藝重復性的研究 按照以上工藝流程,以實施例1方法得到的一批發酵上清連續三次驗證純化工藝,結果如下
*平均總得率為33.6%。
6.純化工藝的中試 6.1超濾更換緩沖液選用Millipore Pellicon 10K超濾膜堆,Millipore Masterflex蠕動泵,超濾器進口壓力、出口壓力分別控制為6psi、3psi,流速為120ml/min,超濾膜先后用注射用水、緩沖液20mMNaAc-HAc,0.15MNaCl,pH5.0平衡好后,對發酵上清液進行超濾。當超濾至原來體積的五分之一時,補加緩沖液20mM NaAc-HAc,pH5.0至原來體積,如此反復操作三次,最后補加緩沖液20mM NaAc-HAc,pH5.0至原來體積作為陽離子交換層析上樣液。
6.2陽離子交換層析將超濾后發酵上清液上SP Sepharose F F陽離子交換層析層析柱,柱規格為Index70/500mm,填料高度7.5cm,柱床體積為300ml,平衡緩沖液為20mM NaAc-HAc,pH5.0,洗脫緩沖液分別為20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0、20mM NaAc-HAc,0.50M NaCl,pH5.0、20mM NaAc-HAc,1.0M NaCl,pH4.0,收集20mM NaAc-HAc,0.50M NaCl,pH5.0洗脫峰。
6.3陰離子交換層析將陽離子交換層析20mMNaAc-HAc,0.50MNaCl,pH5.0洗脫液調節pH值至9.0,稀釋電導至3.0mS/cm以下,上Q Sepharose F F陰離子交換層析,規格為36/30,填料高度6cm,柱床體積為60ml,平衡緩沖液20mM Tris-HCl,pH9.0,洗脫緩沖液分別為20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0,和20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,pH9.0,收集20mM Tris-HCl,0.15MNaCl,pH9.0洗脫峰。
6.4凝膠過濾層析將陰離子交換層析20mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH9.0洗脫液分批上分子篩Superdex 75,規格為60/600mm預裝柱,柱床體積為1700ml,每次上樣量為不超過柱床體積的5%(85ml),緩沖液為20mM NaAc-HAc,0.15M NaCl,pH5.0,分段收集,將純度大于95%的樣品合并,除菌后即為rBAT原液。
6.5連續三批中試產品純化結果見下表 批號20030601
批號20030602
批號20030603
實施例4-10 藥物組合物 將實施例1制得的高純化的基因重組巴曲酶(rBAT原液I)與含有下表中的各輔料組分的注射用水溶液混合,得到重組巴曲酶液體制劑。

√代表該組配方選擇了本輔料。
實施例11-17 穩定性測試實施例 參見實施例4-10的配方組成。
37℃穩定性實驗結果 實施例4-10的重組巴曲酶制劑規格均為1KU/ml,也就是說在各個檢測點,將100ul含重組巴曲酶的某一配方的溶液同100ul的經抗凝處理的人標準血漿混合,在37℃下,能在60±20秒內凝固。超出范圍的均算不合格。
在進行制劑穩定性試驗時,將原液稀釋至活性濃度為1KU/ml進行。
實施例4-10的重組巴曲酶制劑存放在37℃下,于各個檢測點的凝血時間(秒)。見下表
>196s表示超出血凝儀的最大量程仍沒有凝血發生。
結果表明,使用水解明膠作為保護劑,可以使重組巴曲酶顯示出較高的穩定性,能在37℃下穩定100天以上。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之后,本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1. 一種純化的重組巴曲酶,其特征在于,所述的巴曲酶具有以下特性
(a)分子量為29-32kDa;
(b)所述重組巴曲酶中至少90%巴曲酶具有正確的6對二硫鍵配對Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199;
(c)在SEQ ID NO1中第146位和第225位被N-型糖基化修飾;和
(d)所述巴曲酶的比活性大于等于1500KU/mg蛋白。
2. 如權利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述重組巴曲酶中至少95%巴曲酶具有正確的6對二硫鍵配對。
3. 如權利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述巴曲酶中的糖基化是在以下位點Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228中的Asn氨基酸殘基中發生N-糖基化修飾。
4. 如權利要求3所述的巴曲酶,其特征在于,其N-型糖基化修飾可使巴曲酶蛋白的分子量在25.6kDa的基礎上增加4000-6000kDa。
5. 如權利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述巴曲酶的比活性1500-3000KU/mg。
6. 如權利要求1所述的巴曲酶,其特征在于,所述巴曲酶中至少99%具有正確的6對二硫鍵配對。
7. 一種如權利要求1所述的純化的重組的巴曲酶在制備止血藥物中的應用。
8. 一種藥物組合物,其特征在于,它含有權利要求1所述的巴曲酶和藥學上可接受的載體。
9. 如權利要求8所述的藥物組合物,其特征在于,所述的組合物還含有水解明膠作為穩定劑。
10. 如權利要求8所述的組合物,其特征在于,所述的組合物為液體或凍干粉的形式。
全文摘要
本發明公開了一種基因重組巴曲酶,它具有以下特性(a)分子量為29-32Kda;(b)所述重組巴曲酶中至少90%巴曲酶具有正確的6對二硫鍵配對Cys7-Cys139,Cys26-Cys42,Cys74-Cys230,Cys118-Cys184,Cys150-Cys163和Cys1174-Cys199;(c)在SEQ ID NO1中第146位和第225位被糖基化;和(d)所述巴曲酶的比活性大于1500KU/mg。
文檔編號C12N9/50GK101275126SQ20071003891
公開日2008年10月1日 申請日期2007年3月30日 優先權日2007年3月30日
發明者黃秀東, 陳佩新, 潘學工, 強 王, 曹之舫 申請人:上海萬興生物制藥有限公司
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