一種從矛頭蝮蛇毒中提取單一成份巴曲酶的方法

文檔序號:441715
專利名稱:一種從矛頭蝮蛇毒中提取單一成份巴曲酶的方法
技術領域
本發明涉及一種從矛頭蝮蛇的兩個亞種(Bothrops moojeni或Bothrops atrox)蛇毒中提取具有降纖溶栓作用或止血作用的巴曲酶的方法,屬于醫藥技術領域。
背景技術
蛇毒中含有豐富的蛋白水解酶,主要有兩類,一類是蛇毒類凝血酶,在體外引起血液的凝固,在體內卻是去纖抗凝的成份;另一類是蛇毒纖溶酶,可直接降解血纖維,大部分也能降解纖維蛋白原。蛇毒類凝血酶是研究較早、并已在臨床上廣泛應用的一類酶。
蛇毒類凝血酶作為藥物用于治療血栓性疾病已有30多年的歷史,在臨床上有兩個方面的用途。一為降纖作用,即巴曲克栓酶,如東菱迪芙(來自于Bothrops moojeni),主要用于腦梗塞、血栓閉塞性脈管炎、股動脈栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。目前巴曲克栓酶注射液在臨床上已廣泛應用于多種疾病的治療,包括缺血性腦血管病、急性心肌梗塞、突發性耳聾、急性腦梗塞、難治性腎病綜合癥、糖尿病性周圍神經病、肺原性心臟病、不穩定性心絞痛、高粘血癥、心源性腦栓塞,療效確切,不良反應輕微;二為止血作用,即巴曲止血酶,如立止血,也稱蛇毒血凝酶(來自于Bothrops atrox),可用于多種原因引起的出血,特別是應用傳統止血藥無效的出血病人,療效確切,未發現明顯的不良反應。巴曲克栓酶及巴曲止血酶統稱為巴曲酶。
天然蛇毒中提取的類凝血酶絕大多數為酸性蛋白質,因此多采用陰離子交換柱進行分離,并結合凝膠過濾、親和層析和反相液相色譜等方法純化。已報道的巴曲酶制備方法包括(1)蛇毒預處理后進行二乙氨基乙基-葡聚糖凝膠A 50(DEAE-Sephadex A50)陰離子交換層析和分子篩Sephadex G 100層析分離該工藝預處理過程煩瑣,造成酶活性成份損失較多,影響產品的比活力和收率,且在預處理中用到苯酚及其衍生物、甲醇等有機溶劑,影響后期的純化,不適于規?;a。
(2)蛇毒預處理后進行肝素-溴化氰-瓊脂糖凝膠4B(Heparin-CNBr-Sepharose 4B)親和層析分離該工藝預處理方法雖較前法略簡單,但在預處理中同樣用到苯酚的衍生物,且工藝活性收率較低,僅為7.4%,不適于規?;a;(3)苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)一步親和層析分離該工藝所用親和介質的配基苯甲脒(Benzamidine)為絲氨酸蛋白酶類的抑制劑,蛇毒作為天然蛋白含有多種類凝血酶的同工酶,均屬絲氨酸胰蛋白酶,可同時與配基發生結合,因此,特異性不高,所得樣品中巴曲酶的純度較差。
我們參照文獻工藝進行試驗,結果如下

根據試驗結果,認為僅用苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)一步親和層析分離根本達不到分離純化的要求,而且文獻報道的數據與實際不符。
綜上所述,文獻工藝或很難達到理想的分離制備要求,取得單一成份產品,或很難實現規?;纳a目的,因而無法用于實際生產。

發明內容
本發明的目的在于公開一種能夠在工業上實現的從矛頭蝮蛇毒中提取單一成份巴曲酶的方法。
本發明的步驟包括(1)蛇毒用緩沖液I浸泡、溶解過夜,然后離心去除沉淀,得上清液;(2)蛇毒上清液上親和層析柱,用緩沖液I進行洗脫,至蛋白檢測儀讀數達到基線,再用緩沖液II洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;(3)巴曲酶粗提液直接流經葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱,去除苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL);(4)去除苯甲脒鹽酸鹽的巴曲酶粗提液用透析膜或超濾裝置或脫鹽柱更換緩沖液III;(5)巴曲酶粗提液上經緩沖液III平衡的陽離子交換層析柱,使用離子強度梯度緩沖液或pH值梯度緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集樣品溶液;(6)樣品溶液經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋濃縮,或經超濾濃縮,再經分子篩層析柱,用緩沖液IV洗脫,即得單一組份巴曲酶。
在上述步驟中,緩沖液I是pH6.0~10.0含0.1~2.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液或甘氨酸-NaOH緩沖液或磷酸鹽(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)緩沖液。
緩沖液II是pH6.0~10.0含0.1~0.5M NaCL和0.1~0.5M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液或甘氨酸-NaOH緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
緩沖液III是pH5.0~6.5、濃度為0.001~0.05M的磷酸鹽緩沖液或乙酸鹽(乙酸鈉-乙酸)緩沖液或枸櫞酸鹽(枸櫞酸鈉-枸櫞酸)緩沖液或Tris-HCL緩沖液。
緩沖液IV是pH4.0~8.0含0.01~0.5M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液或Tris-HCL緩沖液或磷酸鹽緩沖液或乙酸鹽緩沖液。
步驟(2)中所述親和層析柱是指苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)或苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)層析柱;步驟(5)中所述的陽離子交換層析柱是指磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose)、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose)或羧甲基瓊脂糖凝膠(CM Sepharose)層析柱。
步驟(6)中所述的分子篩層析柱是指丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)或丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)或Superdex-75層析柱。
本發明的技術關鍵點是在用苯甲脒瓊脂糖凝膠(Benzamidine Sepharose)親和層析后,增加陽離子交換柱層析,使樣品的電泳純度能夠達到70%~80%,再經過分子篩層析,即可取得純度較好(電泳純度能夠大于95%,符合藥用標準,見附圖1)、比活力較高(可達1200~1600BU/mg蛋白)的單一成份巴曲酶,產品總收率可達到25%~35%,使巴曲酶的生產完全實現規?;?。
與現有技術相比本發明的優良效果如下本發明工藝設計合理,工藝過程簡單,易于控制,便于操作,重復性好;工藝過程對目標蛋白的活性無明顯損害,分離效果好,能夠達到較高的樣品純度和較高的活性收率;一次處理蛇毒量大,適合規?;I生產。
為取得較好收率和純度,在生產過程中,上述方案中可同時或分別單獨采用下述的幾方面的具體操作1、步驟(2)中的親和層析柱和步驟(3)中的脫鹽柱在樣品洗脫過程中可根據設計需要串聯在一起或分開。
2、上述步驟(5)中的離子強度梯度或pH值梯度洗脫的梯度可采用下述方案階段梯度或直線梯度,梯度為0~1.0M NaCL或pH值4.0~9.0。
3、將本發明的各步驟在3~8℃的環境下進行操作。


附圖為本發明所得樣品巴曲酶的電泳純度圖譜。
具體實施例方式
以下實施例將進一步說明本發明,但不限制本發明。
實施例一
本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒3g,溶于60ml pH8.6含1.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH8.6含1.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH8.6含1.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.6含0.2M NaCL和0.1M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.0濃度為0.01M磷酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH6.0濃度為0.01M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0-1.0M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH5.0含0.1M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1500BU/mg蛋白,活性收率為31%。
實施例二本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于80ml pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH9.0含0.1M NaCL和0.2M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.2濃度為0.02M磷酸鹽緩沖液;6、羧甲基瓊脂糖凝膠(CM Sepharose F.F.)層析柱經pH.6.2濃度為0.02M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.1-1.0M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH7.0含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為96%,比活力為1250BU/mg蛋白,活性收率為28%。
實施例三本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于80ml pH8.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于3℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH8.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH8.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.0含0.3M NaCL和0.15M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.8濃度為0.015M磷酸鹽緩沖液;6、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose F.F.)層析柱經pH5.8濃度為0.015M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.2-1.0M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH6.8含0.3M NaCL的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為97%,比活力為1380BU/mg蛋白,活性收率為35%。
實施例四本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于80ml pH9.0含1.5M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液中,于6℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含1.5M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH9.0含1.5M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液進行洗脫,至蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.8含0.3M NaCL和0.2M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.2濃度為0.015M乙酸鹽緩沖液;6、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose F.F.)層析柱經pH6.2濃度為0.015M乙酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0-0.8M NaCL的乙酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上Superdex-75分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH6.8含0.2M NaCL的乙酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為99%,比活力為1580BU/mg蛋白,活性收率為30%。
實施例五本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒3g,溶于60ml pH7.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于3.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH7.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH7.0含0.1M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH10.0含0.2M NaCL和0.25M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.5濃度為0.04M磷酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH5.5濃度為0.04M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.1-0.8M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH7.4含0.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1352BU/mg蛋白,活性收率為29%。
實施例六本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒4g,溶于65ml pH7.5含1.2M NaCL的磷酸鹽緩沖液中,于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH7.5含1.2M NaCL的磷酸鹽緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH7.5含1.2M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.0含0.2M NaCL和0.25M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.9濃度為0.02M枸櫞酸鹽緩沖液;6、羧甲基瓊脂糖凝膠(CM Sepharose F.F.)層析柱經pH5.9濃度為0.02M枸櫞酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.05-1.0M NaCL的枸櫞酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH6.0含0.3M NaCL的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為97%,比活力為1456BU/mg蛋白,活性收率為31%。
實施例七本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于70ml pH6.8含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液中,于8℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH6.8含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH6.8含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.5含0.3M NaCL和0.3M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.0濃度為0.02M乙酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH6.5濃度為0.02M乙酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.1-0.9M NaCL的乙酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH5.0含0.25M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為97%,比活力為1466BU/mg蛋白,活性收率為31%。
實施例八本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于60ml pH8.0含1.0M NaCL的磷酸鹽緩沖液中,于4.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH8.0含1.0M NaCL的磷酸鹽緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH8.0含1.0M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.5含0.2M NaCL和0.5M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.8濃度為0.03M枸櫞酸鹽緩沖液;6、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose)層析柱經pH5.8濃度為0.03M枸櫞酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用pH值6.5-9.0的Tris-HCL緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;
7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH7.2含0.3M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為99%,比活力為1516BU/mg蛋白,活性收率為27%。
實施例九本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒3g,溶于60ml pH9.5含2.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于6℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.5含2.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH9.5含2.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.0含0.1M NaCL和0.3M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.8濃度為0.015M磷酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH5.8濃度為0.015M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用pH值6.0-8.5的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上Superdex-75分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH6.4含0.3M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為97%,比活力為1425BU/mg蛋白,活性收率為28%。
實施例十本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒4g,溶于70ml pH9.0含1.6M NaCL的磷酸鹽緩沖液中,于5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含1.6M NaCL的磷酸鹽緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;
3、上樣結束后用pH9.0含1.6M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.0含0.3M NaCL和0.18M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.6濃度為0.015M枸櫞酸鹽緩沖液;6、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose)層析柱經pH5.6濃度為0.015M枸櫞酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.15-0.7M NaCL的枸櫞酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1280BU/mg蛋白,活性收率為26%。
實施例十一本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒3g,溶于80ml pH8.5含1.2M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液中,于3.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH8.5含1.2M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH8.5含1.2M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH10.0含0.5M NaCL和0.1M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.4濃度為0.008M磷酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH5.4濃度為0.008M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.1-0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上Superdex-75分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH5.0含0.01M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1444BU/mg蛋白,活性收率為32%。
實施例十二本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于65ml pH10.0含1.8M NaCL的磷酸鹽緩沖液中,于3℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH10.0含1.8M NaCL的磷酸鹽緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH10.0含1.8M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH7.0含0.5M NaCL和0.2M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.3濃度為0.001M磷酸鹽緩沖液;6、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose)層析柱經pH5.3濃度為0.001M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.1-0.7M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH8.0含0.01M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為99%,比活力為1278BU/mg蛋白,活性收率為29%。
實施例十三本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒4g,溶于70ml pH6.5含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液中,于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH6.5含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH6.5含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;
4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH7.0含0.1M NaCL和0.4M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.7濃度為0.04M枸櫞酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱pH5.7濃度為0.04M枸櫞酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用pH值5.8-9.0的枸櫞酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上Superdex-7分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH7.0含0.4M NaCL的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為99%,比活力為1312BU/mg蛋白,活性收率為33%。
實施例十四本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒3g,溶于60ml pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于4.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH7.5含0.4M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH8.0含0.4M NaCL和0.5M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.0濃度為0.03M磷酸鹽緩沖液;6、羧甲基瓊脂糖凝膠(CM Sepharose)層析柱經pH6.0濃度為0.03M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用pH值6.0-9.0的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH7.0含0.1M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為99%,比活力為1368BU/mg蛋白,活性收率為28%。
實施例十五
本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒3g,溶于80ml pH8.0含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液中,于5.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH8.0含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH8.0含1.8M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH6.0含0.1M NaCL和0.3M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.0濃度為0.001M枸櫞酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH5.0濃度為0.001M枸櫞酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用pH值5.0-8.0的枸櫞酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH4.0含0.2M NaCL的乙酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1186BU/mg蛋白,活性收率為25%。
實施例十六本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于70ml pH7.0含1.4M NaCL的磷酸鹽緩沖液中,于4℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH7.0含1.4M NaCL的磷酸鹽緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH7.0含1.4M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH6.5含0.3M NaCL和0.3M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;
5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.7濃度為0.02M乙酸鹽緩沖液;6、羧甲基瓊脂糖凝膠(CM Sepharose)層析柱經pH5.7濃度為0.02M乙酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.05-0.8M NaCL的乙酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上Superdex-75分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH4.0含0.001M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為96%,比活力為1255BU/mg蛋白,活性收率為29%。
實施例十七本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒5g,溶于70ml pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于6.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH9.0含0.6M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH9.0含0.4M NaCL和0.3M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.2濃度為0.01M Tris-HCL緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH6.2濃度為0.01M Tris-HCL緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0-0.9M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH5.8含0.2M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1400BU/mg蛋白,活性收率為27%。
實施例十八本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒4g,溶于75ml pH7.0含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液中,于3℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH7.0含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH7.0含1.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH9.5含0.4M NaCL和0.5M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的磷酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.4濃度為0.01M枸櫞酸鹽緩沖液;6、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose)層析柱經pH6.4濃度為0.01M枸櫞酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用pH值6.2-8.6的枸櫞酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上Superdex-75分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH5.0含0.01M NaCL的乙酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為97%,比活力為1280BU/mg蛋白,活性收率為31%。
實施例十九本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒3g,溶于80ml pH10.0含0.8M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于7℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH10.0含0.8M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH10.0含0.8M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH7.0含0.3M NaCL和0.1M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.1濃度為0.025M磷酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH6.1濃度為0.025M磷酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.05-0.9M NaCL的磷酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經超濾濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH5.0含0.5M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為97%,比活力為1088BU/mg蛋白,活性收率為27%。
實施例二十本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒4g,溶于70ml pH10.0含2.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液中,于5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH10.0含2.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH10.0含2.0M NaCL的甘氨酸-NaOH緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH9.0含0.3M NaCL和0.2M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH6.0濃度為0.035M枸櫞酸鹽緩沖液;6、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose)層析柱經pH6.0濃度為0.035M枸櫞酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用pH值6.0-8.5的枸櫞酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH7.0含0.5M NaCL的Tris-HCL緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1602BU/mg蛋白,活性收率為26%。
實施例二十一本實施例的具體步驟如下1、取矛頭蝮蛇毒4g,溶于65ml pH7.5含1.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液中,于3.5℃冰箱中浸泡使其充分溶解,然后8000rpm離心10min,去除沉淀,收集蛇毒上清液;2、苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)親和層析柱(2.6cm×30cm)用pH7.5含1.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液至少平衡5個柱體積,將上述蛇毒上清液上柱,控制流速0.3ml/min;3、上樣結束后用pH7.5含1.2M NaCL的Tris-HCL緩沖液進行洗脫,至核酸蛋白檢測儀讀數達到基線;4、將親和層析柱與葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱(1.6cm×100cm)連接,用pH9.0含0.5M NaCL和0.2M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的甘氨酸-NaOH緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;5、巴曲酶粗提液用透析的方法置換pH5.8濃度為0.05M乙酸鹽緩沖液;6、磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose F.F.)層析柱經pH5.8濃度為0.05M乙酸鹽緩沖液平衡至少10個柱體積,將巴曲酶粗提液上柱分離,分別用含0.05-0.6M NaCL的乙酸鹽緩沖液進行階段梯度洗脫或直線梯度洗脫,收集樣品峰;7、樣品經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、濃縮至約3ml,上丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)分子篩層析柱(1.6cm×100cm),用pH8.0含0.5M NaCL的乙酸鹽緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得到單一成份的巴曲酶。檢測純度為98%,比活力為1361BU/mg蛋白,活性收率為25%。
本發明所得樣品照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(中國藥典2005版二部附錄VF第五法)檢測純度。其中,marker為低分子量標準蛋白,標準品為巴曲酶標準品,樣品為按本發明實施例制備方法所得的巴曲酶樣品,只顯示一條電泳帶,掃描純度大于95%。(見附圖)
權利要求
1.從矛頭蝮蛇的兩個亞種(Bothrops moojeni或Bothrops atrox)蛇毒中提取單一成份巴曲酶的方法,步驟包括(1)蛇毒用緩沖液I浸泡、溶解過夜,然后離心去除沉淀,得上清液;(2)蛇毒上清液上親和層析柱,用緩沖液I進行洗脫,至蛋白檢測儀讀數達到基線,再用緩沖液II洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集得巴曲酶粗提液;(3)巴曲酶粗提液直接流經葡聚糖凝膠G25(Sephadex G25)脫鹽柱,去除苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL);(4)去除苯甲脒鹽酸鹽的巴曲酶粗提液用透析膜或超濾裝置或脫鹽柱更換緩沖液III;(5)巴曲酶粗提液上經緩沖液III平衡的陽離子交換層析柱,使用NaCl離子強度梯度緩沖液或pH梯度緩沖液洗脫,核酸蛋白檢測儀檢測樣品峰,收集樣品溶液;(6)樣品溶液經聚乙二醇20000(PEG20000)包埋濃縮,或經超濾濃縮,經分子篩層析柱,用緩沖液IV洗脫,即得單一組份巴曲酶。在上述步驟中,緩沖液I是pH6.0~10.0含0.1~2.0M NaCL的Tris-HCL緩沖液或甘氨酸-NaOH緩沖液或磷酸鹽(磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)緩沖液;緩沖液II是pH6.0~10.0含0.1~0.5M NaCL和0.1~0.5M苯甲脒鹽酸鹽(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL緩沖液或甘氨酸-NaOH緩沖液或磷酸鹽緩沖液;緩沖液III是pH5.0~6.5、濃度為0.001~0.05M的磷酸鹽緩沖液或乙酸鹽(乙酸鈉-乙酸)緩沖液或枸櫞酸鹽(枸櫞酸鈉-枸櫞酸)緩沖液或Tris-HCL緩沖液;緩沖液IV是pH4.0~8.0含0.01~0.5M NaCL的檸檬酸鹽緩沖液或Tris-HCL緩沖液或磷酸鹽緩沖液或乙酸鹽緩沖液;步驟(2)中所述親和層析柱是指苯甲脒瓊脂糖凝膠6B(Benzamidine Sepharose 6B)或苯甲脒瓊脂糖凝膠4B(Benzamidine Sepharose 4B)層析柱;步驟(5)中所述的陽離子交換層析柱是指磺丙基瓊脂糖凝膠(SP Sepharose)、甲基磺酸鹽瓊脂糖凝膠(S Sepharose)或羧甲基瓊脂糖凝膠(CM Sepharose)層析柱;步驟(6)中所述的分子篩層析柱是丙烯葡聚糖凝膠S200(Sephacryl S200)或丙烯葡聚糖凝膠S100(Sephacryl S100)或Superdex-75層析柱。
2.根據權利要求1所述的從蛇毒中提取單一成份巴曲酶的方法,其特征在于所述步驟(2)中的親和層析柱和步驟(3)中的脫鹽柱在樣品洗脫過程中可串聯在一起或分開。
3.根據權利要求1或2所述的從蛇毒中提取單一成份巴曲酶的方法,其特征在于所述步驟(5)中的離子強度梯度或pH值梯度洗脫的梯度為0~1.0M NaCL或pH值4.0~9.0。
4.根據權利要求1或2所述的從蛇毒中提取單一成份巴曲酶的方法,其特征在于各步驟在3~8℃的環境下進行。
全文摘要
一種從蛇毒中提取具有降纖溶栓作用或止血作用的巴曲酶的方法,屬于醫藥技術領域。步驟包括如下蛇毒經浸泡溶解、離心;上清液經親和柱層析;洗脫液直接流經葡聚糖凝膠G25脫鹽層析;含有效成份的洗脫液經包埋、濃縮;濃縮樣品再經分子篩層析,即可得到單一成份的巴曲酶。本方法具有適合規?;a、操作簡便、生產周期短、產品純度高等特點。
文檔編號C12N9/74GK101078009SQ20061004459
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月25日 優先權日2006年5月25日
發明者劉祿娟, 張潤平, 于萍, 張明會, 王晶翼 申請人:齊魯制藥有限公司
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