一種高通量農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法

文檔序號:202912
專利名稱:一種高通量農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法
技術領域
本發明涉及一種玉米轉基因方法,尤其涉及農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法。
背景技術
玉米(Zea mays L.)是重要的糧食、飼料和工業原料兼用作物,是我國和世界主要的農作物之一。隨著工業和畜牧業的發展,以及世界人口的增長,玉米在農業生產中的地位越來越重要。2003年以來,我國的玉米播種面積和產量呈現出不斷增長的趨勢,但與我國的玉米需求量還有較大缺口,尤其與美國等玉米生產大國還有較大的差距。因此,不斷增長的玉米需求量對我國的玉米農業生產提出了更高的要求。目前,我國的玉米生產仍以常規雜交育種為主體,因其育種周期長、種質資源匱乏等缺點,這就對我國的玉米育種工作者提出了前所未有的挑戰。因此,開展玉米轉基因技術研究是我國目前玉米生產現狀的迫切需求。轉基因技術克服了物種間的限制,使優良的基因在動植物和微生物之間相互交流,彌補了常規雜交育種種質資源匱乏的不足。將轉基因技術與玉米常規育種相結合,能盡快培育出符合育種目標的玉米新品種,顯著的縮短了玉米育種周期。自Frorrn等人于1990 首次報道了第一例可育的轉基因玉米以來,全世界已有多個轉基因玉米品種被批準進入商業化生產。通過轉基因技術已經培育了一大批抗除草劑、抗旱、抗蟲、耐鹽等優良的轉基因玉米品種。目前,在玉米轉基因技術研究上,已建立了多個轉化方法,包括基因槍法、農桿菌介導法、PEG介導法、花粉管通道法、超聲波法、顯微注射等方法。但在玉米轉基因過程中應用的比較成熟的是農桿菌介導法和基因槍法。而這些方法在組織培養、轉化效率以及受體基因型等方面存在著各種不足,難以滿足目前生產上應用的玉米骨干自交系的轉化需求。 因此,發展和建立一種簡便高效的不需要組織培養和不受玉米基因型限制的轉基因技術顯得尤為迫切。原位轉化(In planta),又叫活體轉化、整體轉化,是一種農桿菌介導的在植物活體狀態下實現目的基因整合的轉基因方法,其主要特征是不需要經過繁瑣組織培養和繼代培養過程而直接獲得轉化種子,顯著縮短了轉基因育種周期。原位轉化方法是雙子葉植物擬南芥遺傳轉化廣泛采用的一種方法,現已成功應用到蕓薹屬作物上。目前,該技術在禾本科植物玉米的遺傳轉化中的應用并不成熟。本發明方法利用特制的電動注射儀將含有目的基因的農桿菌轉化液注入到玉米雌穗最內層苞葉空隙處,并對轉化液各參數進行了優化, 獲得了較高的轉化效率。本發明方法效率高、簡便易行、成本低,適用于不同玉米種質的遺傳轉化。

發明內容
本發明解決的問題在于改進現有的農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,提供一種簡便高效的玉米轉基因技術。本發明的具體方案為
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—種高通量農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,農桿菌菌株為 LBA4404或EHA105,質粒為PCAMBIA1301,篩選標記為除草劑,包括以下步驟步驟1 對農桿菌進行增殖培養,病毒基因誘導培養后,配制農桿菌轉化液;步驟2 將步驟1的農桿菌轉化液注入玉米雌穗最內層苞葉的空隙處,浸泡雌花序一定時間后進行授粉;步驟3 收獲種子播種后,對幼苗進行除草劑抗性篩選;步驟4 對具有除草劑抗性的植株進行PCR檢測篩選。上述步驟1的增殖培養方法為將凍存的農桿菌株接種于含50mg/L卡那霉素和 50mg/L利福平的YEP平板上,于避光培養2d后,從YEP平板上挑取單菌落接種于含上述抗生素的YEP液體培養基中J8°C,230rpm培養16_24h ;吸取上述過夜培養物按1 50 的比例接種于含有相應抗生素的YEP液體培養基中擴大培養,280C 230rpm振蕩培養4_6h, 至 0D600 值為 0. 6-0. 8。上述步驟1的病毒基因誘導培養方法為經增殖培養的農桿菌菌液離心后收集菌體,按照離心前菌液體積1 50的比例,用AB誘導液懸浮菌體,然后于條件下 150-180rpm震蕩培養12h,進行農桿菌的Vir基因誘導培養;所述的AB誘導培養液含3g/ L K2HP04、lg/L NaH2P04、lg/L NH4C1、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0· 15g/L KCl、0.01g/L CaCl2, 0. 0025g/L FeS04 ·7Η20、0. 5g/L MES、2mM Na3P04、5g/L蔗糖、5g/L 葡萄糖、IOOuM 乙酰丁香酮,pH 為 5. 6。上述步驟1的配制農桿菌轉化液為將經病毒基因誘導培養后的農桿菌菌液離心后,用MS轉化液重新懸浮菌體,轉化液0D600值調整為0. 8-1. 0,此菌液即為農桿菌轉化液; 其中,MS 轉化液為組分為:1/4MS,2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2, 4-D、IOOuM 乙酰丁香酮,pH 為 5. 8。進一步,步驟2的農桿菌轉化液在注入玉米雌穗最內層苞葉的空隙之前,添加 0. 03% -0. 05%表面活性劑Silwet L-77 ;注射時使用電動注射儀;玉米雌穗在抽絲前用紙袋套住,于轉化液注入24h后進行授粉。上述電動注射儀包括轉化液容器、壓力電泵、壓力控制閥、塑料軟管、注射控制閥、注射針頭;壓力電泵位于轉化液容器底部并和塑料軟管相連;壓力電泵在壓力控制閥的控制下,將轉化液容器中的轉化液壓入塑料軟管;塑料軟管一端連接壓力電泵,另一端通過注射控制閥連接注射針頭;注射控制閥為按壓式,按壓打開注射控制閥,放開關閉注射控制閥;打開注射控制閥,被壓力電泵壓入塑料軟管中的轉化液通過注射針注射。本發明的有益效果包括1.本發明在進行農桿菌轉化液注入到玉米雌穗最里層苞葉時,用電動注射儀取代了手動注射器,極大地提高了工作效率。該方法每人每天完成6000-8000植株的轉化,可充分利用玉米盛花期進行授粉,提高了玉米植株的結籽率,為較高的遺傳轉化效率提供了保障。另外,電動注射儀壓力均勻,對玉米雌穗損傷較手動注射要小,在一定程度上保證了轉化效率。2.原位轉化方法在模式植物擬南芥中應用非常廣泛,在農桿菌浸泡花序時,采用真空輔助處理,能顯著提高轉化效率。但真空處理并不能應用于玉米這種花器較大的植物。 該方法在農桿菌轉化液中添加適宜濃度的表面活性劑Silwet L-77,增強玉米雌花序對農桿菌的吸附能力。同時使農桿菌轉化液與玉米花器的各個部分充分接觸,為農桿菌中T-DNA 高效的整合提供了條件。3.玉米植株授粉后,可直接收獲種子,不需經過繁瑣的組織培養和植株再生過程, 顯著地縮短了玉米轉基因周期,加快了玉米轉基因育種進程。4.本發明適合于不同的玉米品種,轉化效率不會受到基因型的限制,可滿足目前生產上應用的玉米骨干自交系的轉化要求,簡單高效。本發明僅需簡單的設備和常規試劑, 可一次性完成大規模的植株轉化。5. T1代玉米轉基因植株的篩選采用除草劑噴灑2-3葉期幼苗,不依賴于抗生素篩選,操作簡單、成本低。


圖1是本發明電動注射儀結構示意圖。圖2是本發明PCR檢測抗性植株結果圖。
具體實施例方式下面將通過具體實例介紹本發明具體實施過程。1.材料和方法1. 1玉米品種品種為目前生產上應用的玉米骨干自交系aieng58,但本發明適用的玉米品種沒有具體限制。1. 2農桿菌菌株及外源基因農桿菌菌株為LBA4404或EHA105,質粒為PCAMBIA1301,篩選標記為除草劑(bar)。2.農桿菌的培養及轉化液的制備農農桿菌株轉化液的制備包括三個過程增殖培養、病毒基因誘導培養、轉化液的配置。具體的操作過程如下1、從-70°C凍存的農桿菌株LBA4404-1301-bar刮取少量菌體,接種于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP平板上,于避光培養2d ;2、從YEP平板上挑取單菌落接種于含上述抗生素的YEP液體培養基中J8°C, 230rpm 培養 16_24h ;3、吸取上述過夜培養物按1 50的比例接種于含有相應抗生素的YEP液體培養基中擴大培養,280C 230rpm振蕩培養4_6h,至0D600值為0. 6-0. 8 ;4、經增殖培養的農桿菌菌液離心后收集菌體,按照離心前菌液體積1 50的比例,用AB誘導液懸浮菌體,然后于條件下150-180rpm震蕩培養12h,進行農桿菌的Vir 基因誘導培養;所述的AB誘導培養液含3g/L K2HP04、lg/L NaH2P04、lg/L NH4C1、0. 3g/ L MgS04 · 7H20、0. 15g/L KC1、0. Olg/L CaC12、0. 0025g/L FeS04 · 7H20、0. 5g/L MES、2mM Na3P04、5g/L蔗糖、5g/L葡萄糖、IOOuM乙酰丁香酮,pH為5. 6。5、經病毒基因誘導培養后的農桿菌菌液離心后,用MS轉化液重新懸浮菌體,轉化液0D600值調整為0. 8-1. 0,此菌液即為農桿菌轉化液;其中,MS轉化液為組分為1/4MS、 2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2,4_D、100uM 乙酰丁香酮,pH 為 5. 8。
3.農桿菌轉化液的注射從試驗田中選取生長健壯的玉米植株,在玉米雌穗抽絲前用紙袋將其套住,當花絲抽出雌穗苞葉4-5cm時,開始注射。首先將農桿菌轉化液,添加0.03%-0.05% (V/V)濃度的表面活性劑Silwet L-77后,裝入電動注射儀中,然后從雌穗下部將注射儀針頭插入雌穗最內層苞葉處,按住壓力開關3-5秒,然后將針頭拔出,注射完畢。一次后重復一次注射。 然后用剪刀將花絲貼近苞葉處剪平,注射后24h后開始授粉。上述電動注射儀如圖1所示, 包括轉化液容器1、壓力電泵2、壓力控制閥3、塑料軟管4、注射控制閥5、注射針頭6 ;壓力電泵2位于轉化液容器1底部并和塑料軟管4相連;壓力電泵2在壓力控制閥3的控制下, 將轉化液容器1中的轉化液壓入塑料軟管4 ;塑料軟管4 一端連接壓力電泵2,另一端通過注射控制閥5連接注射針頭6 ;注射控制閥5為按壓式,按壓打開注射控制閥5,放開關閉注射控制閥5 ;打開注射控制閥5時,被壓力電泵2壓入塑料軟管4中的轉化液通過注射針6 注射。壓力電泵2由內置的電池組驅動。4.轉化體的篩選待植株種子成熟后收獲T1代種子,脫粒并曬干,然后播種。待幼苗長至2-3葉期, 開始進行除草劑抗性篩選。除草劑(Basta)要均勻的噴灑到每一顆幼苗的葉片上,濃度為 0.1%。一周后觀察哪些幼苗是具有抗性植株。5.轉化體的PCR的檢測對除草劑篩選表現抗性的玉米植株,分別掛牌編號,將其葉片取回,采用CTAB法提取葉片基因組。根據載體中bar基因序列設計特異性引物,引物序列如下Bar-F 5' GCCTCGAGATGAGCCCAGAACGACG 3‘Bar-R 5' GCCTCGAGTCAGATCTCGGTGACGG 3‘以抗性植株的DNA為模板進行PCR檢測(L1-L5),含bar基因的質粒為陽性對照 ⑴,以未轉化玉米植株葉片DNA為陰性對照㈠,反應條件如下
94 "C 94 "C 65 "C 72 "C 72 "C反應體系如下10XPCR buffer :5μ LdNTP (IOmM) 1 μ LBar-F(IOuM) :2 μ LBar-R(IOuM) :2 μ LDNA模板0· 6μ LTaq 酶0· 4μ LddH20 補足 50 μ LPCR擴增后的產物在含有0. 5 μ g/mL溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB)的1. 0%
5 min 45 sec 30 sec 30 sec IOmin
32 cycles瓊脂糖凝膠上電泳,產物大小為^Obp。結果顯示選取的5株抗性玉米植株PCR檢測均為陽性,如圖2所示。通過除草劑抗性篩選和PCR分子檢測,表明外源基因已經成功地整合到玉米基因組中,整個流程操作簡單,轉化頻率高,為玉米轉基因技術提供了一種簡便、高效的新方法。
權利要求
1.一種高通量農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,農桿菌菌株為 LBA4404或EHA105,質粒為PCAMBIA1301,篩選標記為除草劑,包括以下步驟步驟1 對農桿菌進行增殖培養,病毒基因誘導培養后,配制農桿菌轉化液;步驟2 將步驟1的農桿菌轉化液注入玉米雌穗最內層苞葉的空隙處,浸泡雌花序一定時間后進行授粉;步驟3 收獲種子播種后,對幼苗進行除草劑抗性篩選;步驟4 對具有除草劑抗性的植株進行PCR檢測篩選。
2.根據權利要求1所述的農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,所述的步驟1的增殖培養方法為將凍存的農桿菌株接種于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEP平板上,于觀!避光培養2d后,從YEP平板上挑取單菌落接種于含上述抗生素的 YEP液體培養基中,28 V,230 rpm培養16-24 h ;吸取上述過夜培養物按1 50的比例接種于含有相應抗生素的YEP液體培養基中擴大培養,28 0C 230 rpm振蕩培養4-6 h,至0D_ 值為 0. 6-0.8。
3.根據權利要求1所述的農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,所述步驟1的誘導培養方法為經增殖培養的農桿菌菌液離心后收集菌體,按照離心前菌液體積 1 50的比例,用AB誘導液懸浮菌體,然后于條件下150-180rpm震蕩培養12h,進行農桿菌的Vir基因誘導培養;所述的AB誘導培養液含3g/L K2HP04、lg/L NaH2P04Ug/L NH4Cl、0.3g/L MgS04*7 Η20、0· 15g/L KCl、0· Olg/L CaC12、0. 0025g/L FeS04*7H20、0. 5g/ L MES、2 mM Na3P04、5g/L 蔗糖、5g/L 葡萄糖、100 uM 乙酰丁香酮,pH 為 5. 6。
4.根據權利要求1所述的農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,所述步驟1的配制農桿菌轉化液為將經誘導培養后的農桿菌菌液離心后,用MS轉化液重新懸浮菌體,轉化液OD6tltl值調整為0. 8-1. 0,此菌液即為農桿菌轉化液;所述MS轉化液為組分為 1/4MS、2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2,4_D、100uM 乙酰丁香酮,pH 為 5. 8。
5.根據權利要求1所述的農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,所述步驟2的農桿菌轉化液在注入玉米雌穗最內層苞葉的空隙之前,添加0. 03% - 0. 05%表面活性劑 Silwet L-77。
6.根據權利要求1所述的農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,農桿菌轉化液注入玉米雌穗使用電動注射儀;所述電動注射儀包括轉化液容器(1)、壓力電泵 (2)、壓力控制閥(3)、塑料軟管(4)、注射控制閥(5)、注射針頭(6);壓力電泵(2)位于轉化液容器⑴底部并和塑料軟管⑷相連;壓力電泵⑵在壓力控制閥⑶的控制下,將轉化液容器(1)中的轉化液壓入塑料軟管;塑料軟管(4) 一端連接壓力電泵O),另一端通過注射控制閥( 連接注射針頭(6);注射控制閥( 為按壓式,按壓打開注射控制閥(5), 放開關閉注射控制閥(5);打開注射控制閥(5)時,被壓力電泵(2)壓入塑料軟管(4)中的轉化液通過注射針(6)注射。
7.根據權利要求1所述的農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其特征在于,玉米雌穗在抽絲前用紙袋套住,于轉化液注入24h后進行授粉。
全文摘要
本發明公開了一種高通量農桿菌介導的玉米基因原位轉化方法,其主要步驟包括1、含有外源目的基因的農桿菌轉化液的培養;2、轉化液添加表面活性劑SilwetL-77后用電動注射儀將該轉化液注入到玉米雌穗最內層苞葉的空隙處,使其浸泡雌花序,然后進行授粉;3、將收獲種子播種后,對玉米幼苗除草劑抗性篩選,對除草劑抗性植株進行PCR檢測,獲得轉基因植株。本方法避免了組織培養過程中對外植體基因型要求嚴格的缺陷和植株再生的過程,縮短了玉米轉基因周期,利用電動注射儀每人每天可完成6000-8000株玉米的轉化,可獲得大量的轉化體,進行玉米轉基因研究。
文檔編號A01H5/00GK102533851SQ20121002199
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月31日 優先權日2012年1月31日
發明者何紅升, 周建, 朱蘇文, 程備久, 趙陽, 項艷, 馬慶 申請人:安徽農業大學
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